Ал комплект: ✅ ООО «АЛ-КОМПЛЕКТ», 🏙 Москва (OГРН 5137746041032, ИНН 7720795762, КПП 772001001) — 📄 реквизиты, 📞 контакты, ⭐ рейтинг

Оптимальную безопасность движения и отличный комфорт обеспечивают функциональные и надежные запчасти для прицепов фирмы AL-KO. Высококачественные тормоза наката и системы осей, а также интелигентные решения шасси и инновационные принадлежности являются ключевыми показателями наших достижений. Ориентированные на запросы потребителей конструктивные решения для караванов и грузовых автоприцепов обеспечивают повышенную безопасность движения в сложных ситуациях и надежную перевозку любых грузов.

Страна запчастей и аксессуаров. Товары для дома и отдыха

Теплое время года, особенно весна и лето — это сезон велосипедов, прогулок на природе и семейного отдыха. Но велосипед будет комфортным и принесет удовольствие только в том случае, если он подобран правильно. О выборе и особенностях покупки велосипеда для взрослых (мужчин и женщин) читайте . ..

Трудно найти ребенка, которому не нравились бы активные игры на улице, и каждый ребенок с самого мечтает об одной вещи — велосипеде. Выбор детских велосипедов — ответственная задача, от решения которой зависит радость и здоровье ребенка. Типы, особенности и выбор детского велосипеда — …

При ремонте или изготовлении различной техники и приборов часто возникает необходимость изготовления резьбовых соединений — в таких ситуациях на помощь приходят резьбонарезные наборы. Об этих наборах, их существующих типах и комплектации, а также б выборе и правильном применении — …

В любой момент может понадобиться инструмент, которого, как обычно, не будет под рукой. Справиться с этой проблемой помогут мультиинструменты (мультитулы). О том, что такое мультитул, каких типов он бывает, как устроен и какой может иметь функционал, а также о выборе этого приспособления — …

Рихтовка кузова автомобиля требует применения специального набора инструментов, в котором обязательно присутствует монтировка. О том, что такое рихтовочная монтировка, каких типов она бывает и как используется, а также о подборе и некоторых аспектах применения данного инструмента — читайте …

Для финишной обработки лакокрасочных покрытий, поверхностей металлических и неметаллических изделий применяется специальный инструмент — полировальный круг. Все о полировальных кругах, их существующих типах, характеристиках и применяемости, а также о подборе и работе с кругами читайте в этой …

При выполнении многих работ с узлами, имеющими трущиеся детали, возникает необходимость дозированной подачи масла — на помощь в таких ситуациях приходят рычажные масленки. О том, какие бывают масленки, как они устроены и работают, а также о выборе и применении этих приспособлений — …

Среди современных ручных инструментов особое место занимают углошлифовальные машины, или просто «болгарки». О том, что такое углошлифовальная машина, каких типов она бывает, как устроена и какие имеет характеристики, а также о некоторых особенностях выбора и применении инструмента — читайте …

Стрела (комплект колен АЛ, АПК)

Стрела (комплект колен АЛ, АПК)

3. 3. Стрела (комплект колен АЛ, АПК) — основной элемент конструкции, обеспечивающий действия пожарных в пределах рабочего поля движения стрелы (люльки) АЛ (АПК).

Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации. academic.ru. 2015.

• Стрела
• стрела (комплект колен)

Смотреть что такое «Стрела (комплект колен АЛ, АПК)» в других словарях:

• стрела (комплект колен) АЛ, АПК, ППП — 3.20. стрела (комплект колен) АЛ, АПК, ППП: Основной элемент конструкции, обеспечивающий действия личного состава боевого расчета в пределах рабочего поля движения стрелы (колен) или люльки. Источник: ГОСТ Р 12.2.144 2005: Си …   Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

• стрела (комплект колен) — 3.33 стрела (комплект колен): Комплект звеньев (колен) ППП, телескопически или шарнирно соединенных между собой, обеспечивающий маневрирование устройствами для подачи ОТВ в пределах рабочего поля движения стрелы. Источник: ГОСТ Р 53330 2009:… …   Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

• Стрела — 118. Стрела Конструкция крана, обеспечивающая необходимое значение вылета и (или) высоту подъема грузозахватного органа Источник: ГОСТ 27555 87: Краны грузоподъемные. Термины и определения …   Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

• ГОСТ Р 12.2.144-2005: Система стандартов безопасности труда. Автомобили пожарные. Требования безопасности. Методы испытаний — Терминология ГОСТ Р 12.2.144 2005: Система стандартов безопасности труда. Автомобили пожарные. Требования безопасности. Методы испытаний оригинал документа: 3.2. базовое шасси: Автомобильное шасси, специально изготовленное либо серийно… …   Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

• НПБ 191-2000: Техника пожарная. Автолестницы и автоподъемники пожарные. Термины и определения — Терминология НПБ 191 2000: Техника пожарная. Автолестницы и автоподъемники пожарные. Термины и определения: 3.19. Аварийный привод АЛ (АПК) система устройств, предназначенная для приведения АЛ (АПК) из рабочего в транспортное положение в случае… …   Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

• ГОСТ Р 53329-2009: Техника пожарная. Автоподъемники пожарные. Общие технические требования. Методы испытаний — Терминология ГОСТ Р 53329 2009: Техника пожарная. Автоподъемники пожарные. Общие технические требования. Методы испытаний оригинал документа: 3.1 аварийный привод: Система механизмов, предназначенная для приведения АПК из рабочего положения в… …   Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

Alcotes® — AlcotesPRO® — Alkol Kontrol Testi

Alcotes® «Tarımsal Kökenli Etil Alkol» ile «Metil Alkol» ‘ü ayırt etmenizi sağlayan pratik, güvenilir ve hızlı bir kittir.

Sağlıklı sonuç alabilmek adına kullanım talimatına uyulması büyük önem arzetmektedir.

Ее тест kiti tek kullanımlık olup, kullanım hatalarından kaynaklanan problemler, kullanıcıya aittir.

Kapağı açılmamış Alcotes® test kitinin dayanıklılık süresi belirtilen şartlar altında 2 yıldır.

Sağlıklı sonuç alabilmek adına kullanım talimatına uyulması büyük önem arzetmektedir.

Тест tüpü vidalı kapakardımı ile dik konumda açılır.

İçerisinde bulunan toz bileşiğin üzerine, тест edilecek alkolden bir enjektörardımı ile tüpte işaretli çizgi 5cc olana kadar doldurulur.

Tüp 15 saniye iyi bir şekilde çalkalanır ve ardından durulanması için düz bir zemin üzerine dik konumda yerleştirilerek gözlemlenmeye başlanır.

Тест bittikten sonra tüp su ile yıkanır ve uygun bir atık toplama alanına atılır.

Alcotes PRO® hem etil ve metil alkolü ayırt eden, hem de alkollü içeceklerin orijinal mi, yoksa sahte mi olduğunu gösteren taşınması kolay, hızlı, pratik bir test kitidir.

Sağlıklı sonuç alabilmek adına kullanım talimatına uyulması büyük önem arzetmektedir.

Ее тест kiti tek kullanımlık olup, kullanım hatalarından kaynaklanan problemler, kullanıcıya aittir.

Kapağı açılmamış Alcotes PRO® test kitinin dayanıklılık süresi belirtilen şartlar altında 2 yıldır.

Sağlıklı sonuç alabilmek adına kullanım talimatına uyulması büyük önem arzetmektedir.

Test tüpü dik konuma getirilir ve kapağı çekerek açılır. Тест edilecek alkollü içecekten enjektör veya pipetardımı ile 3 мл tüpün içerisine boşaltılır. Tüpün ağzı kapak bastırılarak kapatılır.

Tüp aralıksız olarak aşağı yukarı yönde 45 saniye iyice çalkalanır. Tüp çalkalama biter bitmez, kapak kısmı yere gelecek şekilde bir zemin üzerine konduktan sonra aldığı renk gözlemlenir.

Test bu konuma getirildikten sonra KESİNLİKLE tekrar çalkalanmamalıdır.Çalkalanması durumunda farklı renge dönüşebilir.

ORJİNAL ALKOLLÜ İEÇEK

Тест tüpünde şeffaf bir görüntü meydana gelir.

effaf ancak kızıla çalan koyu çay rengi bir görüntü verir.

ETİL ALKOL: Önce süt renginde kirli beyaz bir görünüm olur ve bu görünüm 1 dakika içerisinde şeffaf hale gelir.Тест tüpü içerisindeki reaktan tüpün dibinde toplanır.

METIL ALKOL: Tüp çalkalandıktan sonra tüm reaktan metil alkol ile karışır ve bulanık bir görüntü olur. Бу bulanıklık etil alkoldeki gibi berraklaşmaz.

Alcotes PRO® test edildiği andaki renk ile değerlendirilmesi gereken bir testtir. Тест tüpü bu süreçten sonra bekletildiğinde renk değişiklikleri olabilir. Тест bittikten sonra tüp su ile yıkanır ve uygun bir atık toplama alanına atılır.

НЕ:

Tüpü çocuklardan uzak tutunuz, tüpün içerisindeki maddeleri yemeyiniz, göz ile temas ettirmeyiniz.

Alcotes® Alkol Kontrol Testi

Alcotes® Alkol Kontrol Testinin; Metil Alkol, Etil Alkol, Metil Alkol + Etil Alkol Karışımı ve Su ile uygulamalı anlatımı youtube kanalımız üzerinde Uzm. Д-р Серхан КУРТУЛМУГ тарафиндан ачикланмактадыр.

Lütfen Dikkat: Alcotes ile elde ettiğiniz test sonuçları; тест yapıldıktan sonra 1 saatlik süre içerisinde geçerlilik taşımaktadır.Uzun süre bekletilen tüplerde, тест sonuçlarına uygun olmayan renk değişimleri gerçekleşebilir.

ALCOTES® ve ALCOTES PRO® YAKMA TESTİ

Тест tüpünün içerisindeki muhteviyatın tamamı bir çay tabağına boşaltılır. Karanlık bir yerde yakılır. Этил алкоголь МАВИ АГИРЛИКЛИ, МАВИ САРИ renkte yanar. Метил алкоголь YEŞİL renkte yanar.

ETİL METİL KARIIMI ise içerisinde bulunan metil oranına göre MAVİ YEŞİL yanar.

Smok Elektronik Sigara Modelleri ve Fiyatları: https://www.smokelektroniksigara.net

Марка: Курить Урун Коду: 545 Smok RPM80 Pro Pod Mod 80W Kit, Fiyat, Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: НАТУРА Урун Коду: 518 Natura Frozen Fruits Salt Likit 60 мл (Dondurulmuş Meyveler Mentol) Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: НАТУРА Урун Коду: 517 Natura Sweet Melon Salt Likit 60ml (Кавун Ментол) Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: НАТУРА Урун Коду: 516 Natura Banana Salt Likit 60мл (Муз) Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: НАТУРА Урун Коду: 515 Natura Клубничная соль Likit 60 мл (Çilek) Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: НАТУРА Урун Коду: 511 Натуральная двойная яблочная соль Likit 60 мл (Yeşil Kırmızı Elma) Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 492 Smok RPM 40 Kit Pod Mod 40 Вт — 1500 мАч Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 481 Smok Nord Coil / Mesh / Ceramic / Regular 5li Paket Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Стручок Урун Коду: 451 Vaporesso Renova Zero Pod 650mah Elektronik Sigara Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Стручок Урун Коду: 450 Smok Nord Pod Sistem 1100 мАч 3 мл Электроник Сигара, Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ВАПОРЕССО Урун Коду: 752 Катушка Vaporesso Revenger iç Atomizer 3 lü Paket, Satış Fırsat Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: JOYETECH Урун Коду: 240 Распылитель Joyetech Ego One Clr (катушка) 5 li Başlığı Seti, Fiyat, Satın Al, 0. 5 Ом, 1,0 Ом, 1,5 Ом, Satış Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: JOYETECH Урун Коду: 241 Joyetech Cubis Pro Atomizer SS316 (Coil) 5 li Set, Satış, Satın Al, Coil, Satış En Ucuz Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: JOYETECH Урун Коду: 245 Joyetech Ultimo Coil, iç Atomizer Başlık, Satış Fırsat Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 543 Smok RPM 80 Pod Mod Kit 40 Вт 3000 мАч, Smok RPM80 elektronik sigara sitemizden satın al’abilir uygun fiyat ile kapıda ödeme yapabilirsiniz Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 519 Комплект Smok Mag P3 230 Вт, Elektronik Sigara Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ВАПОРЕССО Урун Коду: 487 Комплект Vaporesso PodStick Pod 900 мАч Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Стручок Урун Коду: 486 Smok Novo 2 Pod Mod 800 мАч Электроник Сигара Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 482 Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ВАПОРЕССО Урун Коду: 478 Комплект Vaporesso Luxe S 220 Вт, Elektronik Sigara Fiyatları Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 477 Smok Morph 219 Kit Elektronik Sigara Сети Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ВАПОРЕССО Урун Коду: 454 Vaporesso Luxe Nano 80W Elektronik Sigara 2500 мАч Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 453 Smok Stick V9 Max Kit 60 Вт 4000 мАч Elektronik Sigara, Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Стручок Урун Коду: 452 Justfog C601 Pod Sistem 650mah Elektronik Sigara, Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Стручок Урун Коду: 447 Justfog Minifit Pod Elektronik Sigara, г. Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ВАПОРЕССО Урун Коду: 418 Vaporesso Luxe, inceleme, Fiyat, En Ucuz, Satın AL, Vaporesso Luxe SKRR 220W Elektronik Sigara, Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ВАПОРЕССО Урун Коду: 413 Vaporesso Armor Pro Fiyat, Satın AL, En Ucuz, Vaporesso Armor Pro 100W Elektronik Sigara, Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ВАПОРЕССО Урун Коду: 412 Vaporesso Polar Kapıda Ödeme, Kampanya, indirim, En Ucuz, Satın AL, Vaporesso Polar Set 220W Elektronik Sigara, Satış Fiyat Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 378 Smok X Priv, Fiyat, Satın AL, En Ucuz, Satış, Smok X Priv 225W TFV12 Prince Elektronik Sigara, Satış Fırsat en ucuz Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 359 Smok Stick Prince Kit, Smok Stick Prince 3000 Mah, Satış, Sipariş, En Ucuz, Smok Stick Prince Elektronik Sigara, Sipariş Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 358 Smok G Priv 2 Kit Luxe Edition 230 Вт, Elektronik Sigara, Prince Türkiye, Fiyat, Satın AL, Smok G-Priv 2, Satın AL Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 403 Smok Mag Kit 225W Elektronik Sigara-Satın AL Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ВАПОРЕССО Урун Коду: 691 Мини-комплект Vaporesso Revenger, 85 Вт, canlandırma modülü ve 3. 5 мл NRG SE Tank ile birlikte geliyor. Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ВАПОРЕССО Урун Коду: 689 Vaporesso Revenger X, Fiyat, En ucuz, Satın AL, Satış, Vaporesso Revenger X Kit 220W Elektronik Sigara, en ucuz Kampanya Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 408 Smok G Priv 2, Satın AL, Fiyat, En Ucuz, Satış, Sipariş, Smok G Priv 2 230 Вт Smok G-Priv 2 Dokunmatik Ekran Elektronik Sigara, Satış ürünü en ucuz Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ВАПОРЕССО Урун Коду: 686 Комплект Vaporesso Swag, Fiyat, Satın AL, En Ucuz, Satış, Vaporesso Swag Kit 80 Вт, Elektronik Sigara, en ucuz Fiyat Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 225 Комплект Smok AL85, Fiyat, Satın AL, Smok AL85 Elektronik Sigara, Fırsat Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: ELEAF Урун Коду: 216 Eleaf iStick Pico 75W, Fiyat, Satın AL, Elektronik Sigara, iStick Pico, en ucuz Fırsat Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: JOYETECH Урун Коду: 212 Joyetech eGo AIO, Satın AL, En Ucuz, Fiyat, Satın AL, Satış, Sipariş, Joyetech Ego AIO Kit Elektronik Sigara, en ucuz Yeri Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Марка: Курить Урун Коду: 200 Smok Alien, Smok Alien 220W Fiyat, Satın AL, Elektronik Sigara, Fırsat Satış Фирсат % 0индирим Ucuz Айны Гюн Озель Sınırlı Йени Ток Хедие Toplam 40 ürün bulundu. 1 .sayfa görüntüleniyor.

Kpss Kitaplar, 2020,2021, Benim Hocam, Yds, Dgs, abt, Ygs, Yks, Lgs, Tyt

Kpss Kitaplar, 2020,2021, Benim Hocam, Yds, Dgs, abt, Ygs, Yks, Lgs, Tyt

HAFTANIN OK SATANLARI

Can Kni

1

2021 Беним Хокам CRETSZ TYT-AYT renci Ders Takip Defteri 9786052774120

1

Марка Комисион

2

2021 TYT Problemler Konu zetli Yeni Nesil Soru Bankas Marka Yaynlar 9786058028661

2

Марка Комисион

3

2021 TYT Paragraf Konu zetli Yeni Nesil Soru Bankas Marka Yaynlar 9786058028623

3

Мехмет Кврак

4

TYT Matematik Soru Bankas Drt Be Yaynlar 2021 Модель 9786058136809

4

Кадир Гм

5

2021 TYT Trke Soru Bankas Benim Hocam Yaynlar 9786052773727

5

Мехмет Кврак

6

AYT Matematik Soru Bankas 2021 Модель Drt Be Yaynlar 9786058136816

6

Байрам Мерал

7

2021 TYT Corafya Soru Bankas Benim Hocam Yaynlar 9786052773772

7

ляс Гне

9

2021 TYT Matematik Soru Bankas Benim Hocam Yaynlar 9786052773789

9

Лимит Комисион

10

Kronometre Paragraf Soru Bankas Limit Yaynlar 9786052034286

10

Гксу этин

11

TYT AYT KPSS ALES DGS Paragraf Hz Sorular Hz ve Renk Yaynlar 9786058139305

Карго БЕДАВА

11

Белиз Аэля Тадемир

12

Модель 2021 года, cretsiz, LGS, Planl Solla, Soru Bankas, Lider Plus Yaynlar, 9786053086215, Ders Takip Defteri,

12

Mslm Kaplan

13

TYT Trke Soru Bankas 2021 Модель Drt Be Yaynlar 9786058116221

13

Тонгу Комисион

14

TYT Rehber Matematik Problemler Dizi 321 Soruda Bitir i Tongu Akademi 9786257894524

14

mit Aknc

15

AYT Fizik Soru Bankas Drt Be Yaynlar 9786056959028

15

ляс Гне

16

Tm Adaylar in Taktiklerle Problemler Konu Anlatml Soru Bankas Benim Hocam Yaynlar 9786052774830

16

Хамза Кая

17

SYM Soru Tipleriyle Paragrafn Ritmi Ar Yaynclk 9786052330517

17

Мехмет Сайлан

18

TYT Trke Soru Bankas Limit Yaynlar 9786052751008

18

Билгехан Пери

20

AYT Biyoloji Tamam Video zml Сору Китаб Пальме Яйневи 9786052824573

20

zgr Balc

21

AYT 3D Matematik Tamam Video zml Soru Bankas 3D Yaynlar 9786051944036

21

22

KPSS ALES DGS Ezberbozan Paragraf Soru Bankas Pegem Yaynlar 9786052417959

22

znur Saat Yldrm

23

2021 TYT Soyut Paragraf Soru Bankas Hoca Kafas 9786257248006

23

Али Динснмез

25

AYT Kimya Tamam Video zml Soru Bankas Aydn Yaynlar 9786057945761 Ali Dinsnmez, aydn yayinlari, aydin, aydin AYT kimya soru bankas AYT soru bankas, Ayt kimya, miray yaynlar, AYT KONU ANLATIM, Ayt kimya konu anlatm, yeni nesil sorular, ki

25

Юсуф Глер

26

TM SYM ve MEB Snavlar in Anlayarak Hzl Okuma kitab 657 Yaynlar 9786052312971

26

Rt Bayndr

28

Tm Zamanlarn Tm Snavlar in Tecrbe Taktiklerle Paragraf Soru Bankas Pelikan Yaynevi 9786052268827

28

29

Led Ikl Kitap Okuma Gzl Ylmazlar 8685236523567

29

Стефан Цвейг

30

Olaanst Bir Gece Bankas Kltr Yaynlar 9786053326090

30

Глсерен Будайколу

31

Мадальон Сети (3 Китап) Ремзи Китабеви 8737 Мадальонун и 9789751409935 Гнахн Ренги 9789751412874 Хаята Дн 9789751414601 Глсерен Будайколу

31

lber Ortayl

34

Бир господин Насл Яанр лбер Ортайл Кроник Китап 9789752430990

34

Стефан Цвейг

36

Stefan Zweig 7 li Set Filozof Yaynlar 8807 9786050616941 9786050616934 9786050616958 9786050616965 9786050616972 9786050616989 9786050616996

Карго БЕДАВА

36

SYM Komisyon

37

2021 TYT Маркалар Кармас 7 Фаркл Яйн 7 Факл Йени Несил Денеме Марка Яйнлар 9786257759007

37

Мехмет Каранфил

39

TYT Problemler Soru Bankas Bilgi Sarmal Yaynlar 97862572

39

Марка Комисион

40

TYT Matematik 3×40 Deneme Marka Yaynlar 9788945652164

40

Марка Комисён

41

2021, KPSS, Dil Bilgisi, Konu zetli, Yeni Nesil, Soru Bankas, Marka Yaynlar, 9786257759038

41

Варол Яаролу

42

Muhtiim Dedektifler, Kral akir 9, Eksik Para Yaynlar, 9786257124492

42

Глсерен Будайколу

44

gunahin uc rengi 9789751412874 gulseren budayicioglu remzi kitabevi

44

Курул Комисён

46

345 TYT Trke Nokta At Soru Bankas Kurul Yaynclk 9786057653802

46

50

2021 KPSS Corafya Tamam zml 33 Deneme Hocawebde Yaynlar 9786057733238 Энгин Эрайдн % 45

Многоцелевой набор инструментов для продвинутой геномной инженерии в растениях

ВВЕДЕНИЕ

Геномная инженерия — быстро развивающаяся дисциплина, направленная на разработку стратегий и методов эффективной целевой модификации ДНК в живых клетках. В большинстве подходов к геномной инженерии используются нуклеазы, специфичные для последовательности (SSN), такие как эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), и кластеры с регулярными интервалами между короткими палиндромными повторами (CRISPR) / Cas9, чтобы создать целевой двухцепочечный разрыв ДНК (DSB). в геноме. Затем при репарации ДНК достигается желаемая модификация последовательности ДНК. DSB чаще всего восстанавливаются с помощью негомологичного соединения концов (NHEJ), которое может создавать инсерционные / делеционные (инсерционные) мутации в сайте разрыва, которые нарушают функцию гена.Нокауты генов, опосредованные TALEN или CRISPR / Cas9, были получены у различных видов растений, поддающихся трансформации (Brooks et al., 2014; Fauser et al., 2014; Forner et al., 2015; Gao et al., 2015; Christian et al., 2013; Liang et al., 2014; Shan et al., 2013; Sugano et al., 2014; Xu et al., 2015; Zhang et al., 2014). Признаки коммерческой ценности также были созданы путем целевого нокаута выбранных генов (Wang et al. , 2014; Clasen et al., 2016; Haun et al., 2014; Li et al., 2012, 2016). В качестве альтернативы DSB можно восстановить с помощью гомологически зависимой репарации (HDR), которая копирует информацию из «донорской» ДНК-матрицы.HDR обычно встречается с более низкими частотами, чем NHEJ в соматических клетках, и его сложнее достичь, поскольку он требует введения в растительную клетку как молекулы донорной ДНК, так и кассеты экспрессии SSN. Однако, как описано ниже, в новых стратегиях доставки этих реагентов недавно были достигнуты некоторые улучшения в эффективности (Baltes et al., 2014; Čermák et al., 2015; Fauser et al., 2012; Schiml et al., 2014).

С момента разработки реагентов TALEN и CRISPR / Cas9 технология улучшалась быстрыми темпами.Например, частота indel была увеличена за счет связывания SSN с экзонуклеазами (Certo et al., 2012; Kwon et al., 2012), изменения архитектуры направляющей РНК (gRNA) (Chen et al., 2013) или использования специализированных промоторов (Wang et al. , 2015; Ян и др., 2015). Повышенная специфичность была достигнута с использованием парных никаз TALEN или CRISPR / Cas9 (Ran et al., 2013), усеченных гРНК (Fu et al., 2014) или димерных нуклеаз CRISPR / Cas9 (Guilinger et al., 2014; Tsai et al. ., 2014). Появились и другие разнообразные приложения, в том числе целенаправленная регуляция экспрессии генов, целенаправленная эпигенетическая модификация или сайт-специфическое редактирование оснований посредством дезаминирования (La Russa and Qi, 2015; Kungulovski and Jeltsch, 2016; Zong et al., 2017; Shimatani et al., 2017).

CRISPR / Cas9 особенно полезен для мультиплексного редактирования генов, потому что специфичность мишени определяется короткими гРНК, а не белками, которые необходимо создавать для каждой новой мишени (Baltes and Voytas, 2015). Было разработано несколько систем для одновременной экспрессии нескольких гРНК, и они чаще всего включают сборку нескольких отдельных кассет экспрессии гРНК, каждая из которых транскрибируется с отдельного промотора РНК-полимеразы III (Pol III) (Xing et al. , 2014; Ma et al., 2015; Lowder et al., 2015). Несколько гРНК также могут быть экспрессированы из одного транскрипта. Такие полицистронные мРНК посттранскрипционно процессируются в индивидуальные гРНК ферментами, расщепляющими РНК. Эти ферменты включают CRISPR-ассоциированную РНК-эндорибонуклеазу Csy4 из Pseudomonas aeruginosa (Tsai et al., 2014), ферменты процессинга тРНК, естественным образом присутствующие в клетках-хозяевах (Xie et al., 2015), и рибозимы (Gao and Zhao, 2014).

Одной из значительных оставшихся проблем в инженерии генома растений является достижение высокочастотного редактирования генов с помощью HDR.Как упоминалось выше, HDR требует введения в растительную клетку как молекулы донорной ДНК, так и кассеты экспрессии SSN. Модификации последовательности ДНК, включенные в донорскую матрицу, затем копируются в поврежденную хромосому. Подход нацеливания на ген in planta (GT) стабильно интегрирует донорскую матрицу в геном растения. Это гарантирует, что каждая клетка имеет по крайней мере одну копию донора, которая высвобождается из хромосомы с помощью SSN, что делает ее доступной для HDR (Schiml et al. , 2014; Fauser et al., 2012). Другой подход заключается в увеличении доступности донорской матрицы за счет ее репликации до большого числа копий с использованием репликонов геминивирусов (GVR) (Baltes et al., 2014). GVR позволяют создавать точные модификации без необходимости стабильной интеграции редактирующих реагентов в геном растения (Čermák et al., 2015).

Не все методы и подходы, описанные выше, были реализованы и оптимизированы для использования на заводах. Хотя существует несколько наборов инструментов для инженерии генома растений (Ma et al., 2015; Xing et al., 2014; Lowder et al., 2015), они ограничены тем, что используют один тип реагента, индуцирующего DSB (например, CRISPR / Cas9), один тип системы экспрессии (например, промоторы Pol III для экспрессии гРНК) или они были специализированы для одного приложения (например, нокаут генов). Здесь мы представляем комплексную модульную систему для инженерии генома растений, которая позволяет выполнять нокауты генов, замены, изменение регуляции транскрипции или мультиплексные модификации. Кроме того, платформу можно легко модернизировать и адаптировать для использования новых реагентов и подходов по мере их появления. Наш инструментарий использует клонирование Golden Gate для быстрой и простой сборки инженерных конструкций генома и гибкости в сочетании различных функциональных модулей для различных приложений. Функциональные модули включают реагенты на основе TALE (активаторы TALEN и TALE), реагенты CRISPR / Cas9 (нуклеазы, никазы, каталитически неактивные ферменты и активаторы), различные подходы к экспрессии гРНК (системы экспрессии одной и нескольких гРНК с использованием Pol III или Pol II. промоторы), донорские матричные плазмиды для нацеливания на гены и множество других кассет экспрессии (Trex2, Csy4 и GFP).Кроме того, большой набор промоторов, терминаторов, генов с оптимизированными кодонами и маркеров отбора облегчает конструирование геномов двудольных или однодольных с использованием векторов T-ДНК или не-T-ДНК для трансформации, опосредованной Agrobacterium tumefaciens , биолистической трансформации или трансформации протопластов. Мы также предоставляем удобный веб-портал с протоколами, последовательностями ДНК всех реагентов и веб-инструментами для помощи в проектировании конструкции. Наконец, мы проверили наши реагенты на шести различных видах растений и сообщили об использовании геномной инженерии для создания модифицированных растений Medicago truncatula .

РЕЗУЛЬТАТЫ

Прямая и модульная сборка инженерных конструкций генома

Наш набор инструментов для инженерии генома растений предоставляет два набора векторов, обозначенных как «прямые» и «модульные» (рис. 1). Оба набора векторов могут доставлять в растительные клетки реагенты TALEN или CRISPR / Cas9 для создания целевых модификаций последовательности ДНК. Векторы TALEN полностью совместимы с нашими Golden Gate TALEN и TAL Effector Kit 2.0 (Cermak et al., 2011), и они используют высокоактивную архитектуру TALEN Δ152 / + 63 (Miller et al., 2011). Векторы CRISPR / Cas9 включают либо пшеницу ( Triticum aestivum ), либо Arabidopsis thaliana оптимизированные по кодонам версии Cas9 для использования в однодольных и двудольных, соответственно. Обе версии Cas9 содержат единственный сигнал ядерной локализации на С-конце.

Рисунок 1.

Два набора векторов для прямого клонирования или модульной сборки реагентов для геномной инженерии.

(A) Векторы прямого клонирования были разработаны для ускорения процесса клонирования.Элементы, определяющие специфичность (гРНК или повторы TAL), клонируют непосредственно в основу трансформации (например, Т-ДНК).

(B) Модульные сборочные векторы позволяют комбинировать различные функциональные элементы. Элементы, определяющие специфичность (гРНК, повторы TAL и донорные матрицы для нацеливания гена), сначала клонируют в промежуточные модульные векторы. Затем выбранные пользователем модули собираются вместе в основу трансформации (например, Т-ДНК).

Векторы прямого клонирования (номер 31) позволяют быстро конструировать реагенты для целевого нокаута генов.Они состоят из векторных скелетов (Т-ДНК или не-Т-ДНК), кассет экспрессии селективных маркеров и нуклеаз (т. Е. Cas9 или остова TALEN). Однако у них отсутствуют детерминанты для нацеливания на ДНК (т.е. гРНК или повторы TALE). Одна или несколько gRNA могут быть добавлены за один шаг с использованием протокола Golden Gate (Engler et al., 2008, 2009) (рисунок 1A). Добавление TALEN использует трехэтапный протокол Golden Gate (см. Дополнительные методы для протоколов сборки).

Модульный набор векторов использует клонирование Golden Gate для создания векторов для разнообразного диапазона приложений редактирования генов (рис. 1B; дополнительные методы, протокол 5).Есть три набора модульных векторов клонирования. Набор модулей A содержит готовые к использованию плазмиды (в настоящее время их насчитывается 61) с кассетами экспрессии Cas9 или GFP. Также доступны плазмиды модуля А, которые можно использовать при сборке TALEN с помощью нашего набора Golden Gate (Cermak et al., 2011). Плазмиды модуля В (в настоящее время их номер 22) используются либо для добавления одной или нескольких гРНК в различных форматах экспрессии, либо для добавления второго мономера TALEN. Плазмиды модуля C (в настоящее время нумерация 22) могут использоваться для добавления донорных матриц для нацеливания на гены, дополнительных кассет gRNA или других кассет экспрессии, таких как GFP, Trex2 или Csy4.Каждая кассета экспрессии имеет аналогичную архитектуру (дополнительный рисунок 1): используется общий набор сайтов рестрикционных ферментов, которые позволяют легко менять местами регуляторные элементы (промоторы и последовательности терминаторов) или кодирующие последовательности. Если реагент из данного набора нежелателен, есть пустые модули, которые служат в качестве заполнителей и все же позволяют сборку Golden Gate. Наконец, основу трансформации можно выбрать из набора (в настоящее время насчитывающего 33) векторов Т-ДНК и не-Т-ДНК. Стандартные векторы или векторы GVR доступны с одним из обычно используемых маркеров селекции антибиотиков или без них.Для большинства приложений создание вектора преобразования с использованием модульного набора векторов представляет собой двухэтапный процесс клонирования, который может быть завершен за пять дней; Сборка векторов на основе TALEN обычно требует дополнительного этапа клонирования.

Чтобы облегчить использование нашего набора инструментов, мы разработали онлайн-ресурсы, помогающие в выборе вектора и конструировании дизайна (http://cfans-pmorrell.oit.umn.edu/CRISPR_Multiplex/). На нашем веб-сайте представлен полный список векторов прямого и модульного клонирования с описанием основных функций, файлов последовательностей ДНК и соответствующих протоколов для загрузки (список векторов см. В наборе дополнительных данных 1).Также в Интернете доступен инструмент «выбора вектора», который использует раскрывающееся меню, чтобы помочь идентифицировать подходящие необходимые промежуточные плазмиды (например, модуль A, B или C) или выбрать основу трансформации. Затем инструмент выбора вектора предоставляет ссылку на файл последовательности ДНК выбранной плазмиды, который можно загрузить в формате GenBank. Для мультиплексного редактирования генов наш инструмент «Дизайн праймеров и построение карты» принимает в качестве входных данных файл FASTA с целевыми последовательностями гРНК. Затем готовится список всех последовательностей праймеров, необходимых для создания вектора, который экспрессирует несколько гРНК с использованием наших форматов экспрессии тРНК, Csy4 или рибозима, и создается файл GenBank с аннотированной последовательностью указанного массива гРНК в выбранной остове плазмиды. .

Целевой мутагенез генов в M. truncatula с использованием прямых векторов

Чтобы проверить функциональность прямых векторов, мы разработали пару TALEN для нацеливания на два паралогичных гена в M. truncatula (Medtr4g020620 и Medtr2g013650) (рис. ). Ортолог Arabidopsis, как известно, играет роль в регуляции фосфата, а мутанты гипераккумулируют фосфат (Park et al., 2014). Вектор T-ДНК с TALEN был собран с использованием нашего протокола сборки Golden Gate (Дополнительные методы, протокол 1B) и трансформирован в M.truncatula . Выделили одиннадцать растений T0 и подвергли скринингу на предмет мутаций-мишеней как в Medtr4g020620, так и в Medtr2g013650, используя анализ расщепления ПЦР. Два растения T0 (WPT52-4 и WPT52-5) продуцировали ампликоны ПЦР, устойчивые к расщеплению рестрикционными ферментами (по обеим мишеням в WPT52-4 и по одной мишени в WPT52-5). Растение WPT52-4 самооплодотворяли, и потомство Т1 подвергали скринингу с использованием того же анализа расщепления ПЦР. Мутации были подтверждены в обоих локусах (рис. 2В). Мутации в Medtr4g020620, вероятно, были соматическими, поскольку только два из протестированных растений продуцировали устойчивые к перевариванию ампликоны различной интенсивности.Однако мутации в Medtr2g013650 разделились, как и ожидалось, по признаку, передаваемому через зародышевую линию, и одно из восьми протестированных растений было гомозиготным мутантом. Это было подтверждено секвенированием ДНК, которое выявило четыре различных аллеля с делецией Medtr4g020620 в одном растении и идентичную делецию длиной 63 п.н. в Medtr2g013650 в трех тестируемых растениях T1 (рис. 2С). Из восьми растений T1 мы идентифицировали одно растение с мутациями в обоих генах. Таким образом, TALEN эффективно работают с нашими прямыми векторами и вызывают наследственные мутации.

Рисунок 2.

TALEN-опосредованный мутагенез в M. truncatula с использованием векторов прямого клонирования.

(A) Карты двух M. truncatula генов, нацеленных на мутагенез, с использованием одной пары TALEN. Праймеры для ПЦР, используемые для скрининга в (B) , показаны зелеными стрелками. Последовательность целевого сайта TALEN показана с подчеркнутыми сайтами связывания TALEN.

(B) Hae III ПЦР-скрининг восьми потомков T1 растения WPT52-4.Справа указан амплифицированный локус. bar и ACTIN являются контролями, которые амплифицируют трансген и нативный ген соответственно. HM340 (D), продукт дикого типа, расщепленный Hae III; HM340 (UD), непереваренный продукт дикого типа.

(C) Последовательности ДНК непереваренных ампликонов из растения WPT52-4-4. Контрольная последовательность немодифицированного локуса показана вверху. Сайты связывания TALEN подчеркнуты. Hae III сайт рестрикции, использованный для скрининга, отмечен красным.

Экспрессия множественных гРНК с помощью Csy4, ферментов, обрабатывающих тРНК, и рибозимов

Чтобы использовать одно из самых больших преимуществ системы CRISPR / Cas9, возможность нацеливаться на несколько сайтов одновременно, наша модульная система клонирования предоставляет векторы для мультиплексного редактирования генома. Обычно при мультиплексном редактировании независимые промоторы Pol III используются для управления экспрессией каждой гРНК. Одним из ограничений является то, что для экспрессии Pol III требуется конкретный нуклеотид в первой позиции транскрипта.Кроме того, размер конечного массива может быть громоздким из-за множества повторяющихся промоторных последовательностей. Обработка полицистронных транскриптов, содержащих множественные гРНК, обеспечивает альтернативу использованию независимых промоторов Pol III. Полицистронное сообщение может быть получено из промотора Pol II, который процессируется белком Csy4, ферментами, обрабатывающими тРНК, или рибозимами (Nissim et al., 2014; Aeby et al., 2010; Tang et al., 2016). Промоторы Pol II обеспечивают гибкость с точки зрения пространственного и временного контроля экспрессии in vivo, и они с большей вероятностью продуцируют длинные транскрипты, поскольку Pol II не препятствует наличие коротких сайтов внутренней терминации, как в случае Pol III ( Arimbasseri et al., 2013). Мы стремились сравнить эффективность целевого мутагенеза с использованием пяти различных систем экспрессии гРНК, включая три различных метода обработки полицистронных транскриптов гРНК (рис. 3А). Все векторы были собраны с использованием нашей модульной системы клонирования и использовали две гРНК для нацеливания на два сайта в томате ( Solanum lycopersicum ) AUXIN RESPONSE FACTOR 8A ( ARF8A ) ген, положительный регулятор развития цветков и завязывания плодов (N Лю и др., 2014).

Рисунок 3.

Сравнение различных систем для экспрессии нескольких гРНК.

(A) Структура шести конструкций для экспрессии gRNA9 и gRNA10, которые обе нацелены на ген ARF8A томата . CmYLCV, промотор вируса желтого скручивания листьев цестры ; Csy4, шпилька Csy4 из 20 п.н .; тРНК, пре-тРНК длиной 77 п.н. ^{, ген Gly} ; rb, сайт расщепления рибозима длиной 15 п.н .; рибозим, синтетический рибозим длиной 58 пар оснований; AtU6, промотор U6 арабидопсиса; At7SL, промотор 7SL арабидопсиса.

(B) Возможные результаты редактирования из-за экспрессии обеих гРНК. Последовательности, нацеленные на gRNA9 и gRNA10, показаны вверху. Сайты расщепления указаны стрелками.

(C) Общая частота мутаций, определенная с помощью глубокого секвенирования. Планки погрешностей представляют собой три повторности (пулы протопластов). Статистическая значимость определялась тестом Тьюки. * P <0,05 и *** P <0,001.

Мы создали три вектора, которые используют отдельные промоторы Pol III для экспрессии каждой гРНК: два промотора AtU6, промотор AtU6 и At7SL или промоторы AtU6 и At7SL в сочетании со структурно оптимизированными каркасами гРНК (Chen et al., 2013). Оставшиеся три вектора продуцируют один транскрипт с кассетами пРНК, разделенными шпильками Csy4 длиной 20 п.н. (Tsai et al., 2014), тРНК 77 п.н., ^{генами Gly} (Xie et al., 2015) или сайтами расщепления рибозима длиной 15 п.н. (в дополнение к синтетическому рибозиму на 3′-конце транскрипта) (Haseloff and Gerlach, 1988; Tang et al., 2016). Благодаря преимуществам по сравнению с промоторами Pol III, упомянутыми выше, мы решили использовать промотор Pol II для управления экспрессией полицистронных гРНК. Поскольку Cas9 экспрессировался с промотора 35S, мы выбрали промотор вируса керлинга желтого листа цестры (CmYLCV) для экспрессии гРНК, чтобы предотвратить использование дублирующих промоторов.Промотор CmYLCV управляет сопоставимыми или более высокими уровнями экспрессии, чем промоторы 35S или кукурузы ( Zea mays ) убиквитина ( ZmUbi ) как у двудольных, так и у однодольных (Stavolone et al., 2003), и интенсивность экспрессии GFP от этого промотора был подобен 35S-управляемому GFP в протопластах томатов (дополнительная фигура 2). Конечные векторы котрансформировали в протопласты томатов вместе с плазмидой экспрессии YFP. Эффективность трансформации составляла примерно 60%, как определено путем подсчета YFP-положительных клеток.

Для оценки частоты мутаций целевой сайт амплифицировали с помощью ПЦР из ДНК, полученной из трансформированных протопластов, и подвергали секвенированию ДНК Illumina (дополнительная таблица 1). Все ожидаемые типы мутаций в локусе ARF8A были выявлены во всех образцах, за исключением нетрансформированного контроля (рисунки 3B и 3C; дополнительная таблица 2; дополнительные рисунки с 3 по 7). Интересно, что общая частота мутагенеза была примерно в 2 раза выше с системами экспрессии Csy4 и тРНК по сравнению с конструкциями с двумя промоторами Pol III.Хотя общая частота мутагенеза в образце Csy4 была постоянно выше, чем в образце тРНК в трех повторах, разница не была статистически значимой (рис. 3С; дополнительная таблица 3). Рибозим показал более низкие частоты большинства типов мутаций, особенно в 3′-крайнем сайте-мишени гРНК. Мы не наблюдали какого-либо увеличения общей частоты мутаций с ранее сообщенным улучшенной архитектурой гРНК (Chen et al., 2013). Важно отметить, что частоты мутаций не корректировались с учетом эффективности трансформации ~ 60%; поэтому они занижены.

Делеция между двумя сайтами расщепления CRISPR / Cas9 была наиболее частой мутацией во всех образцах (дополнительный рисунок 3). Короткие индели на одном или обоих сайтах расщепления были более чем в 10 раз менее распространенными (дополнительные рисунки с 3 по 6). Инверсии промежуточной последовательности и делеции в сочетании со вставками встречались более чем в 100 раз реже (дополнительный рисунок 3). Большинство вставок картированы либо в геном томата, либо в векторе, охватывая почти все области векторной последовательности (дополнительный рисунок 7).

Cas9 наиболее часто создает DSB с тупым концом на три нуклеотида выше последовательности PAM (Jinek et al., 2012). В наших экспериментах точное лигирование расщепленной Cas9 ДНК без промежуточной последовательности привело бы к делеции 85 п.н. Прирост или потеря нуклеотидов из-за ступенчатого расщепления Cas9 (Jinek et al., 2012; Li et al., 2015) и / или экзонуклеазной активности могут приводить к более коротким или более длинным делециям. Поразительно, но мы наблюдали очень высокую частоту точного лигирования: в среднем 83.5% всех прочтений с длинными делециями были делециями 85 п.н. (дополнительная фигура 8). Эти результаты предполагают, что при использовании одной гРНК в большинстве случаев репарация NHEJ не приводит к мутации. Следовательно, создание делеций с двумя или более гРНК должно быть более эффективным подходом для достижения целевого мутагенеза.

Мы дополнительно проверили эффективность полицистронных систем экспрессии с использованием восьми гРНК, направленных на удаление четырех генов в протопластах томатов. Мы также отслеживали влияние положения гРНК в массиве.гРНК с 49 по 56 (дополнительная таблица 4) были собраны непосредственно в векторы экспрессии протопластов, не относящихся к Т-ДНК, в двух разных порядках (фигура 4А). В одном массиве гРНК были упорядочены от 49 до 56, а во втором массиве порядок был обратным. Кроме того, был сконструирован вектор, экспрессирующий каждую пРНК с отдельного промотора Pol III. Каждая пара гРНК была разработана для создания делеции размером ~ 3 т.п.н. для предотвращения амплификации неделированных локусов при последующем анализе ПЦР (рис. 4В). Семь векторов трансформировали в протопласты томатов, и частоты делеций, вызванных первой, последней и одной из пар внутренних гРНК в каждом массиве, измеряли с помощью количественной ПЦР (рис. 4С).Как и в предыдущем эксперименте, система экспрессии Csy4 показала лучшие результаты независимо от положения гРНК в массиве. Система тРНК была следующей по эффективности, за ней следовало использование отдельных промоторов Pol III; рибозимная система оказалась наименее эффективной. нРНК около конца массивов Csy4 и тРНК были менее эффективны в мутагенезе по сравнению с гРНК в более ранних положениях для большинства тестируемых локусов, предполагая, что положение действительно влияет на активность гРНК. Тем не менее, независимо от эффектов положения, при использовании Csy4 частота делеций была такой же или выше, чем при использовании отдельных промоторов Pol III, подтверждая, что Csy4 является наиболее эффективной системой для мультиплексного редактирования генов.

Рисунок 4.

Оценка восьми гРНК в различных полицистронных системах экспрессии и влияние положения в матрице на активность гРНК.

(A) Структура семи конструкций для экспрессии гРНК с 49 по 56, направленных на делецию четырех генов томатов.

(B) Обнаружение делеций между сайтами гРНК с помощью кПЦР. Каждый ген нацелен на делецию с помощью двух гРНК, предназначенных для создания делеции размером 3 т.п.н., чтобы предотвратить амплификацию неделированной матрицы дикого типа.Частоту делеции количественно оценивали с помощью кПЦР с использованием праймеров, показанных красными и синими стрелками.

(C) Частоты делеции в протопластах томатов, измеренные с помощью qPCR. Положения соответствующих гРНК в массиве указаны для каждой конструкции. Планки погрешностей представляют собой два повторения.

Мультиплексный мутагенез в протопластах томата, пшеницы и ячменя

Мы дополнительно исследовали эффективность системы Csy4 для мультиплексирования путем нацеливания на шесть генов томата ( Solyc06g074350 , Solyc02g085500

7406

07 Solyc02g085500

7306

07 Solyc02g085500

7306

076 и Solyc02g077390 ), три гена пшеницы ( убиквитин , 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза и локус Mildew O [ TaMLO в ячмене]) и один ; ХвМЛО ).Каждый ген был нацелен на делецию с использованием двух гРНК. Чтобы обеспечить экспрессию в зерновых, мы создали векторы с промоторами ZmUbi , просо ( Panicum virgatum ) убиквитин 1, ( PvUbi1 ) и промоторы просо убиквитин 2 ( PvUbi2 (Mann et al., 2011). ). Последовательности PvUbi1 и PvUbi2 были модифицированы для удаления сайтов Aar I, Sap I и Bsa I, и было подтверждено, что модифицированные промоторы управляют высокими уровнями экспрессии GFP в щитках пшеницы (дополнительный рисунок). 9).Затем мы разработали массивы Csy4 из 12 гРНК, нацеленных на шесть генов в томате, шесть гРНК, нацеленных на три гена в пшенице, и две гРНК, нацеленные на единственный ген в ячмене. В томате промотор 35S использовали для экспрессии Cas9 , а промотор CmYLCV управлял экспрессией gRNA. В пшенице и ячмене ZmUbi использовали для управления экспрессией Cas9, а массив пРНК находился под контролем PvUbi1 . Чтобы проверить, можно ли заменить промотор PvUbi1 на значительно более короткий вирусный CmYLCV для экспрессии гРНК в однодольных, мы также разработали вектор, в котором две гРНК, нацеленные на ген MLO ячменя, контролировались промотором CmYLCV.Конечные векторы, экспрессирующие Cas9 и массив пРНК, трансформировали в протопласты томатов, пшеницы и ячменя, и через 2 дня проводили ПЦР для обнаружения целевых делеций. Делеции ожидаемого размера были обнаружены в каждом целевом гене и подтверждены секвенированием ДНК (рисунки 5–7). И CmYLCV, и PvUbi1 -зависимые массивы гРНК индуцировали направленную делецию гена MLO ячменя с аналогичной эффективностью (фигура 7B). Таким образом, мы подтвердили, что наша система эффективна при одновременном создании множественных целевых делеций генов как в двудольных, так и в однодольных, используя до 12 гРНК.

Рисунок 5.

Мультиплексный мутагенез с использованием системы Csy4 в протопластах томатов.

(A) Карты шести генов томатов, нацеленных на одновременную делецию с использованием 12 гРНК. Сайты гРНК показаны черными стрелками. Стрелки представляют собой праймеры, используемые для обнаружения делеций. Длины продуктов ПЦР из локуса дикого типа показаны справа; длины продуктов делеции указаны в скобках.

(B) Делеции ожидаемой длины были обнаружены в каждом из шести генов с помощью ПЦР.Синими и черными стрелками отмечены неизмененные и удаленные продукты соответственно. В качестве матрицы использовали ДНК дикого типа из нетрансформированных клеток.

(C) ДНК-последовательностей репрезентативных продуктов делеции. Последовательность неизмененного локуса для каждого из шести генов показана вверху. Сайты-мишени гРНК подчеркнуты, а последовательности PAM — красным.

Рисунок 6.

Мультиплексный мутагенез с использованием системы Csy4 в протопластах пшеницы.

(A) Карты трех генов пшеницы, нацеленных на одновременный мутагенез с использованием шести гРНК.Сайты гРНК показаны черными стрелками. Стрелки представляют собой праймеры, используемые для обнаружения делеций. Длины продуктов ПЦР из локуса дикого типа показаны справа; длины продуктов делеции указаны в скобках.

(B) Делеции ожидаемой длины были обнаружены в каждом из шести генов с помощью ПЦР. Синими и черными стрелками отмечены неизмененные и удаленные продукты соответственно. В качестве матрицы использовали ДНК дикого типа из нетрансформированных клеток.

(C) ДНК-последовательностей репрезентативных продуктов делеции.Последовательность неизмененного локуса для каждого из трех генов показана вверху. Сайты-мишени гРНК подчеркнуты, а последовательности PAM — красным.

Рисунок 7.

Промоторы CmYLCV и PvUbi1 функционируют в протопластах ячменя и вызывают целевые делеции с помощью системы экспрессии гРНК Csy4.

(A) Карта гена ячменя MLO , нацеленного на делецию с использованием двух гРНК. Сайты гРНК показаны черными стрелками. Стрелки представляют собой праймеры, используемые для обнаружения делеций.Длина продукта ПЦР из локуса дикого типа показана справа; длина удаляемого продукта указана в скобках.

(B) Делеции между сайтами gRNA38 и gRNA39 были обнаружены в гене MLO ячменя, когда для экспрессии gRNA использовали промоторы CmYLCV или PvUbi1 . Синими и черными стрелками отмечены неизмененные и удаленные продукты соответственно. Показаны две повторы (пулы протопластов) эксперимента.

(C) ДНК-последовательностей репрезентативных продуктов делеции.Последовательность неизмененного локуса для каждого из трех генов показана вверху. Сайты-мишени гРНК подчеркнуты, а последовательности PAM — красным.

Наследственный мультиплексный мутагенез в M. truncatula

Чтобы продемонстрировать эффективность наших мультиплексирующих векторов Csy4 на целых растениях, мы использовали шесть гРНК для нацеливания на четыре гена M. truncatula , которые кодируют клубенько-специфические богатые цистеином (NCR ) пептиды (дополнительная фигура 10). Более 500 генов составляют семейство NCR, и их небольшой размер, идентичность последовательностей и общее количество создают проблемы для традиционных платформ для нокаута / нокдауна, таких как мобильные элементы (Tnt1), интерференция РНК и химический мутагенез.Для удаления одного из трех локусов были сконструированы три пары гРНК: NCR53 , NCR54 ( Medtr4g026818 ) и NCR55 ( Medtr3g014705 ). Локус NCR53 содержит два гомологичных гена NCR, различающихся несколькими SNP (дополнительный набор данных 2) и разделенных примерно 4 т.п.н. Вектор, несущий массив пРНК, кассету экспрессии Cas9 и ген устойчивости bar , трансформировали в M. truncatula , и 46 трансформантов T0, устойчивых к фосфинотрицину, выделяли и подвергали скринингу с помощью ПЦР и прямого секвенирования.Сорок три растения имели мутации в NCR53 , восемь в NCR54 и 12 в NCR55 (таблица 1; дополнительная таблица 5; дополнительный набор данных 2). Мутации включали делеции генов NCR53 и NCR55 , возникшие в результате одновременного расщепления в двух сайтах, а также короткие индели во всех трех локусах в данном целевом сайте. Три растения имели мутации во всех трех генах, 13 были двойными мутантами и 27 имели мутации в одном гене. Несмотря на повторяемость, мутации в локусе NCR53 представляли собой исключительно длинные делеции или инверсии между двумя сайтами расщепления у семи из 46 растений.В сайте gRNA3 не было обнаружено мутаций, вероятно, из-за двух SNP, обнаруженных в целевом сайте. gRNA1, которая нацелена на сайт NCR53 , имеет два несовпадения в затравочной области с сайтом NCR54 и мутацию, разрушающую PAM. Точно так же gRNA2 имеет два несовпадения с сайтом NCR54 , по одному на каждом из 5 ‘и 3’ концов затравочной области. Не наблюдались нецелевые мутации из gRNA1 и gRNA2 в локусе NCR54 у 46 растений, что дополнительно указывает на то, что двух несовпадений в целевом сайте достаточно для предотвращения нецелевой активности.

Таблица 1. Мультиплексный целевой мутагенез в M. truncatula с использованием Cas9 и Csy4

Для подтверждения передачи мутаций следующему поколению растение № 16 (с мутациями в NCR53 и NCR54 ), растение № 17 (с мутации в NCR53 и NCR55 ), растение № 27 (с мутациями во всех трех мишенях) и растение № 40 (с мутациями в NCR53 ) самооплодотворялись. Семь проростков Т1 от каждого родителя Т0 подвергали скринингу с помощью ПЦР и секвенирования ДНК на мутации в соответствующих генах и на присутствие трансгена bar (дополнительные фигуры 11A и 11B).Мутации, идентичные тем, которые наблюдались у родителей T0, были обнаружены в локусе NCR53 в потомстве всех четырех тестируемых растений (дополнительная фигура 11A). У двух из четырех растений (растение № 17 и растение № 40) все протестированные потомки показали только мутированную версию локуса NCR53 . И двойной мутант (растение № 16), и тройной мутант (растение № 27) также передали ожидаемые мутации в NCR54 своему потомству, тогда как только тройной мутант (растение № 27), а не двойной мутант (растение № 17). ) передал мутации в NCR55 .Хотя мы не обнаружили аллель дикого типа NCR53 в растении T0 № 16 или аллель дикого типа NCR55 в растении T0 № 27, аллели дикого типа были восстановлены в потомстве T1, что позволяет предположить, что T0 растения могли быть химерными. Тем не менее, вставка Т-ДНК отделилась в нескольких потомках Т1 растений Т0 №16, №27 (включая тройной мутант 27-6) и №40 (дополнительная фигура 11В), подтверждая, что мутации в этих растениях передавались через зародышевой линии, а не созданной de novo в T1.Таким образом, мы смогли показать, что мутации в каждом из генов наследуются. Кроме того, мы показали, что мутации во всех трех генах могут передаваться одновременно от трижды мутантного родителя (растение № 27) его потомству. Эти результаты показывают возможность использования системы Csy4 для эффективного восстановления наследственных мутаций в нескольких генах.

Направленная делеция 58 т.п.н. в M. truncatula Использование систем мультиплексирования тРНК и Csy4

Для дальнейшей оценки систем Csy4 и тРНК для создания хромосомных делеций в M.truncatula , мы разработали еще один набор из шести гРНК (от MPC1 до MPC6), которые нацелены на область размером 58 т.п.н. на хромосоме 2 (рис. 8А). Этот регион содержит пять генов-кандидатов, выявленных в результате общегеномного исследования ассоциации, которые связаны с симбиотической азотфиксацией (Curtin et al., 2017). ГРНК собирали (в порядке от 1 до 6) в векторы Т-ДНК для прямого клонирования, которые используют ферменты процессинга Csy4 или тРНК (см. Дополнительные методы, протоколы 3A и 3B), и после трансформации ДНК из случайно выбранных каллусов подвергали протестирован с помощью ПЦР на предмет потенциальных хромосомных делеций.Праймеры были сконструированы от 200 до 300 п.н. выше и ниже различных сайтов-мишеней по всему локусу (фиг. 8A; дополнительная таблица 6). Результаты этого предварительного анализа выявили все четыре возможные делеции (обнаруживаемые с помощью этого набора праймеров) в каллусах, трансформированных Csy4, тогда как в каллусах, трансформированных с помощью реагентов мультиплексирования тРНК, была обнаружена только делеция 27 т.п.н. между сайтами гРНК MPC1 и MPC4 ( Рисунок 8B). Последовательность ампликонов, полученных из предполагаемых делеций 58 т.п.н., была подтверждена (фиг. 8C).Еще находясь в культуре ткани, мы предварительно отобрали 46 проростков T0 от каждой из трансформаций Csy4 и тРНК на предмет делеций 27 и 58 т.п.н. Предположительно положительные всходы переносили в почву, выращивали в зрелые растения и снова проверяли с помощью ПЦР. Три растения Csy4 T0 были идентифицированы с делецией 58 kb и два растения с делецией 27 kb. Для растений тРНК Т0 одно растение имело делецию 27 т.п.н. (фиг. 8B). Последовательность дикого типа в удаленной области 58 т.п.н. все еще может быть амплифицирована с другим набором праймеров, что позволяет предположить, что все растения были гетерозиготными или химерными.Одно растение (WPT228-5) оказалось гомозиготным мутантом T0 по делеции 27 т.п.н., поскольку нам не удалось восстановить ПЦР-ампликон из аллеля дикого типа (фиг. 8B).

Рисунок 8. Целевое удаление

58 т.п.н. в M. truncatula .

(A) Карта области хромосомы 2, намеченной для делеции. Голубые прямоугольники обозначают отдельные гены. Сайты гРНК показаны черными стрелками. Праймеры для обнаружения делеций показаны ниже в виде зеленых стрелок.

(B) ПЦР-определение больших делеций в каллусной ткани, растениях T0, T1 и T2.Праймеры, используемые для обнаружения делеций разного размера, указаны справа от каждого изображения геля. Пары праймеров F1a / R1a, F1b / R1b, F1c / R1c, F1d / R1d и F1e / R1e амплифицируют не удаленную последовательность дикого типа. Праймеры bar F2 / R2 амплифицируют трансген bar . NT, без шаблона.

(C) ДНК-последовательности событий делеции 58 kb, амплифицированные с праймерами F3 / R5 из каллусной ткани и растений T0, трансформированных вектором Csy4. Контрольная последовательность немодифицированного локуса показана вверху.Сайты-мишени gRNA подчеркнуты, а последовательности PAM выделены красным.

(D) Фенотипы растений T1, гетерозиготные и гомозиготные по делеции 58 kb. Обратите внимание на карликовый рост мутантов. Изображения были скорректированы таким образом, чтобы минимизировать шум почвы за счет уменьшения яркости белого и нейтрального цветовых каналов. Все изображения были скорректированы одинаково.

Для тестирования наследственной передачи делеций растения Т0 WPT228-28 (Csy4, гетерозиготный или химерный для делеции 58 т.п.н.) и WPT227-28 (тРНК, гетерозиготный или химерный для делеции 27 т.п.н.) самооплодотворяли. , и растения Т1 были проверены на сегрегацию хромосомных делеций.Восемь из 12 проростков T1 дали полосы ожидаемого размера для делеции 58 т.п.н. в потомстве WPT228-28, а семь из семи проростков T1 показали полосы, ожидаемые для делеции 27 т.п.н. в потомстве WPT227-28, что подтверждает передачу зародышевой линии в потомстве WPT227-28. эти строки ( Рисунок 8B ) . Кроме того, аллель дикого типа не был обнаружен в двух из восьми проростков WPT228-28 T1, что позволяет предположить, что эти два проростка являются гомозиготными мутантами. Трансген bar не был обнаружен в трех гетерозиготных проростках WPT228-28, что указывает на потерю вставки Т-ДНК и подтверждает, что мутации не были созданы de novo в T1 (фиг. 8B).Чтобы определить, можно ли восстановить гомозиготные мутанты на фоне без трансгена, растение Т1 WPT228-28-1, гетерозиготное по делеции 58 т.п.н. и не имеющее вставки Т-ДНК, самооплодотворяли, и семь проростков Т2 подвергали скринингу на наличие делеции. ПЦР и секвенирование идентифицировали два гомозиготных и три гетерозиготных нетрансгенных растения (фиг. 8B).

Более низкие общие частоты мутаций по сравнению с теми, что наблюдались в эксперименте по редактированию гена NCR , вероятно, из-за значительно большего размера искомых делеций.Обратная связь между частотой и размером Cas9-опосредованной делеции наблюдалась ранее как в клетках млекопитающих, так и в клетках растений (Canver et al., 2014; Xie et al., 2015; Ordon et al., 2017).

Усиление направленного мутагенеза с помощью Trex2

Для увеличения частоты мутаций, вызванных NHEJ, нуклеазы, специфичные для последовательности, могут быть соединены с экзонуклеазами для ускорения резекции концов и предотвращения точного лигирования. Ранее коэкспрессия экзонуклеазы 2 3′-репарации человека (Trex2) с мегануклеазой приводила к 25-кратному увеличению частоты разрушения генов в клетках человека (Certo et al., 2012). У растений сверхэкспрессия экзонуклеазы 1 (Exo1) значительно увеличивала частоту резекции DSB в каллусах риса ( Oryza sativa ) (Kwon et al., 2012), а Trex2 увеличивал частоту мутагенеза при кодировании в растительные клетки с мегануклеазой ( Луо и др., 2015). Основываясь на этих данных и наших наблюдениях, что большинство вызванных Cas9 разрывов точно воссоединяются, мы проверили влияние на мутагенез экспрессии Trex2 с Cas9 и единственной гРНК. Мы использовали гРНК, которые нацелены на два разных сайта в гене ANT1 томата и один сайт в гене MLO ячменя.Индивидуальные пРНК клонировали под контролем промоторов AtU6 или TaU6, объединяли с оптимизированным для двудольных или однодольных растений слиянием Trex2-P2A-Cas9 и тестировали на протопластах томата и ячменя. Мы наблюдали умеренное увеличение в 1,5–2,5 раза частоты инделирования в присутствии Trex2 по сравнению с образцами без Trex2 в ячмене (по данным анализа T7EI) (рис. 9A). Сходные результаты были получены на томатах (как измерено с помощью секвенирования T7EI и ДНК) (Фигуры 9A и 9B). Секвенирование выявило тенденцию к более длинным делециям в образцах Trex2 как у томатов, так и у ячменя (Фигуры 9B и 9C).В то время как в образцах, лишенных Trex2, делеции ≥10 п.н. не были обнаружены, они составляли 77% (томаты) и 100% (ячмень) всех мутаций, выявленных в образцах, экспрессирующих Trex2. Вставки размером до 42 п.н. были обнаружены в образцах без Trex2 (дополнительная фигура 12), но не в образцах, экспрессирующих Trex2, что позволяет предположить, что делеции индуцировались преимущественно в присутствии экзонуклеазы.

Рисунок 9.

Trex2 усиливает мутагенез в протопластах томата и ячменя.

(A) Результаты анализа эндонуклеазы I Т7 для двух участков в томате и одного участка в ячмене.Для участков томатов показаны две повторы (пулы протопластов) и среднее кратное увеличение частоты мутагенеза. Среднее кратное увеличение в двух экспериментах показано вверху.

(B) ДНК-последовательностей мутаций, полученных из NHEJ, обнаруженных в бактериальных клонах продуктов ПЦР, которые охватывают целевой сайт гРНК в гене ANT1 томата. Мутации показаны в 15 из 92 бактериальных клонов, полученных из клеток томатов, трансформированных только Cas9 и gRNA, и в 26 из 88 бактериальных клонов, полученных из клеток, трансформированных Cas9, gRNA и Trex2.Последовательности трех клонов, содержащих вставки в сайте gRNA, обнаруженные в образце, лишенном Trex2, не показаны. Контрольная последовательность показана вверху. Сайт-мишень гРНК длиной 20 п.н. подчеркнут, а последовательность PAM выделена красным.

(C) ДНК-последовательностей мутаций, происходящих от NHEJ, обнаруженных в бактериальных клонах продуктов ПЦР, которые охватывают целевой сайт гРНК в гене MLO ячменя. Мутации показаны в 18 бактериальных клонах, полученных из клеток ячменя, трансформированных только Cas9 и gRNA, и 19 бактериальных клонах, полученных из клеток, трансформированных Cas9, sgRNA и Trex2.Образцы обогащали мутациями путем переваривания ампликонов ПЦР с помощью Nco I перед клонированием. Контрольная последовательность показана выше; сайт-мишень гРНК длиной 20 п.н. подчеркнут, а PAM выделен красным. Последовательность сайта узнавания Nco I выделена курсивом. Вставка 1 п.н. выделена зеленым.

Нацеливание гена с помощью Cas9 Nickases

Было разработано несколько стратегий для уменьшения частоты нецелевого мутагенеза с помощью CRISPR / Cas9.Среди них — использование парных никаз Cas9, которые создают DSB путем введения зарубок на противоположных цепях ДНК. Парные никазы обладают эффективностью расщепления на мишени, сравнимой с Cas9 дикого типа в клетках и растениях человека (например, Arabidopsis и рис), и снижают нецелевую активность до 1500 раз (Ran et al., 2013; Schiml et al., 2014; Миками и др., 2016). Мы создали вариантов никазы Cas9 путем мутации каталитических остатков в консервативных доменах нуклеаз RuvC (D10A) и HNH (H840A).Затем были созданы векторы модуля A, которые экспрессируют вариантов Cas9, с отдельными или комбинированными мутациями (последние приводят к каталитически мертвому ферменту Cas9).

Мы были заинтересованы в изучении того, могут ли спаренные никазы Cas9 также стимулировать GT в растениях с использованием ранее описанного анализа транзиторных GT табака ( Nicotiana tabacum ). В этом анализе дефектный трансген gus: nptII восстанавливается путем расщепления и гомологичной рекомбинации (фиг. 10A) (Wright et al., 2005; Baltes et al., 2014). Мы разработали пару гРНК в ориентации PAM-out, которые перекрываются на 5 п.н. (смещение -5 п.н.) и должны создавать выступ из 29 п.н. (рис. 10А). Для стимуляции GT реагенты были доставлены в ткань растения на репликонах вируса желтого карлика фасоли (BeYDV) (Baltes et al., 2014; Čermák et al., 2015), доступных в нашем наборе инструментов как основы трансформации T-ДНК. Считывались количество синих (положительных по GUS) пятен и интенсивность окрашивания листьев табака (дополнительная фигура 13A).

Рисунок 10. Нацеливание на гены

с помощью никаз Cas9 и GVR в табаке.

(A) Иллюстрация подхода к нацеливанию на гены в табаке. гРНК gNt_F2 и gNt_R2 нацелены на дефектный трансген gus: nptII , стабильно вставленный в геном табака. Отсутствующая кодирующая последовательность восстанавливается посредством гомологически направленной репарации с использованием донорной матрицы, что приводит к функциональному гену GUS .

(B) Влияние одиночных и двойных надрезов на нацеливание генов в табаке.Гены Cas9, и гРНК были доставлены в листья табака на репликоне BeYDV путем агроинфильтрации. Листья окрашивали в растворе X-Gluc через 5 дней, а синие (GUS-положительные) пятна количественно определяли с помощью анализа изображений. Данные были нормализованы для образца нуклеазы Cas9. Планки погрешностей представляют собой 5 независимых экспериментов. AtCas9, нуклеаза Cas9; AtD10A, никаза Cas9 D10A; AtH840A, никаза Cas9 H840A; (-gRNA), без контроля gRNA.

(C) Последовательности ДНК левого и правого рекомбинационных соединений из листьев, инфильтрированных спаренной конструкцией никазы D10A.Несколько бактериальных клонов были секвенированы и оказались идентичными. Показаны соединения на обоих концах каждого плеча гомологии.

Сначала мы сравнили частоты GT, вызванные одиночным забоем или DSB. Число событий GT, вызванных одиночными порезами, составляло около 70% событий GT, вызванных DSB (рис. 10B). Существенных различий в частотах GT между никазами D10A и H840A не наблюдалось. Затем мы сравнили эффективность GT с использованием парных никаз, которые вызывают двойные разрывы, приводящие к 5′-выступам длиной 29 п.н. (AtD10A) и 3′-выступам (AtH840A).Мы наблюдали двукратное увеличение GT с 5 ‘вылетами по сравнению с 3’. Число событий GT, индуцированных двойными разрывами, создающими 5′-выступы, было даже выше, чем количество событий GT, индуцированных нуклеазой Cas9 дикого типа. Это согласуется с наблюдениями на клетках человека (Ran et al., 2013).

Чтобы подтвердить природу событий GT на молекулярном уровне, мы экстрагировали ДНК из инфильтрированных листьев табака и ПЦР амплифицировали оба соединения вставленной последовательности (дополнительная фигура 13B).Все образцы, за исключением того, который был инфильтрирован вектором, экспрессирующим нерасрезающие гРНК, дали продукты ожидаемого размера для обоих соединений. От шести до 10 бактериальных клонов для каждого соединения из каждого образца были проанализированы путем секвенирования, которое выявило точную интеграцию донорской матрицы во все клоны (рис. 10С). Эти данные предполагают, что общая частота и точность GT, индуцированных никазами, сравнима с подходом на основе нуклеаз, который, как мы ранее показали, может быть использован для эффективного восстановления растений с наследственными модификациями, созданными GT (Baltes et al., 2014; Čermák et al., 2015).

Чтобы увидеть, применим ли подход никазы к GT у однодольных видов, мы нацелили на вставку в рамке считывания кассеты T2A-GFP в третий экзон гена убиквитина в щитках пшеницы, используя Вирус карликов пшеницы (WDV) репликоны, как описано Gil-Humanes et al. (2017). Мы наблюдали экспрессию GFP, согласующуюся со вставкой в ​​локус убиквитина (дополнительные рисунки с 14А по 14С), что указывает на осуществимость этого подхода для разных видов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Геномная инженерия обещает продвинуть вперед как фундаментальные, так и прикладные исследования растений, и мы разработали комплексный набор реагентов, чтобы сделать новейшие технологии геномной инженерии доступными для научного сообщества растений. И TALEN, и CRISPR / Cas9 можно легко комбинировать с различными регуляторными последовательностями, векторами трансформации и другими ферментами, модифицирующими ДНК, что позволяет быстро собирать реагенты, необходимые для нокаута одиночных и мультигенных генов, а также замен генов.

Используя нашу гибкую модульную систему, мы оценили четыре различных стратегии экспрессии мульти-гРНК в протопластах томатов для достижения мультиплексного редактирования. Полицистронный транскрипт гРНК при процессировании бактериальной рибонуклеазой Csy4 приводил к почти в 2 раза большей частоте мутаций по сравнению с обычно используемой стратегией, в которой каждая гРНК экспрессируется с индивидуального промотора Pol III. Кроме того, положение gRNA в матрице имеет лишь умеренное влияние на активность, и последние gRNA в матрице из восьми работают сравнимо с gRNA, экспрессируемыми независимо от промоторов Poll III.Хотя частоты, наблюдаемые с Csy4, были сопоставимы с ранее описанной системой обработки тРНК (Xie et al., 2015), мы отдаем предпочтение системе Csy4, потому что она постоянно давала нам более высокие частоты делеций в протопластах томатов, а транскрипты мульти-гРНК короче и менее повторяющиеся (т.е. сайты узнавания Csy4 составляют 20 п.н. по сравнению с 77 п.н. для тРНК). Хотя система Csy4 требует экспрессии рибонуклеазы Csy4 в растительной клетке, и для процессинга тРНК не требуются дополнительные факторы, ген Csy4 относительно короткий (561 п.н. = 187 аминокислот), и мы обычно выражаем его как слияние P2A. к Cas9 без каких-либо наблюдаемых фенотипических последствий для трансгенных растений.

Хотя ранее мы показали, что транскрипты гРНК, процессируемые рибозимами, эффективно индуцируют мутагенез в рисе, табаке и арабидопсисе (Tang et al., 2016), из механизмов полицистронного процессинга РНК, протестированных в этом исследовании, рибозимы приводили к самым низким частотам мутаций. . Одно различие между двумя исследованиями состоит в том, что мы экспрессировали Cas9 и массив гРНК с разных промоторов, тогда как Tang et al. (2016) использовали одну единицу транскрипции для экспрессии как Cas9, , так и гРНК.Кроме того, частота делеций, созданных двумя гРНК, непосредственно в предыдущем исследовании не измерялась. Возможно, что координированная экспрессия Cas9, и гРНК из одной единицы транскрипции, что невозможно в текущей версии нашей системы клонирования из-за ее модульной структуры, может иметь важное значение для достижения более высоких частот редактирования генов с использованием процессинга рибозима. Верно ли это, еще предстоит выяснить. Тем не менее, мы демонстрируем, что системы экспрессии Csy4 и тРНК эффективно обрабатывают транскрипты мульти-гРНК и обеспечивают высокоэффективное мультиплексное редактирование генов.

Анализ мутаций, возникающих в результате расщепления одного гена двумя гРНК, показал, что примерно 85% DSB были лигированы точно. Это согласуется с высокой частотой точного ремонта, наблюдаемой в

Инновации продолжают менять опыт вейпинга

SMOK® | Инновации постоянно меняют опыт вейпинга

ВНИМАНИЕ: этот продукт содержит никотин. Никотин вызывает привыкание. Только взрослым, НЕСОВЕРШЕННОЛЕТНИМ детям запрещено покупать электронные сигареты.

NORD X КОМПЛЕКТ

Превосходя ожидания

novo X КОМПЛЕКТ

Embrace MTL vaping высшего уровня

КОМПЛЕКТ RIGEL

Искры до конца

ОБОРОТОВ 2 И ОБОРОТОВ 2S КОМПЛЕКТ

Превосходное качество

SCAR-P3 и SCAR-P5

Вдохновение силы шрама

SCAR-18

Родился для исполнения

.

No related posts.