Алоэ лидаза: Лидаза инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Lydase лиофилизат д/пригот. р-ра д/инъекц. и местн. прим. 64 УЕ: фл. 5 или 10 шт. (4383)

IMR-32 в присутствии экстракта белка алоэ вера (AV). (A) Репрезентативные конфокальные изображения, показывающие ядерное окрашивание Ki-67 клеток IMR-32, культивированных с экстрактом белка AV в течение 1, 2 или 5 дней.Окрашивание Ki-67 (зеленый) находится в ядре (синий), которое окрашено TOTO3. Масштабные линейки: 30 мкм для всех панелей. (B) Процент клеток Ki-67 (+) среди общего количества клеток TOTO3 (+). Клетки Ki-67 (+) подсчитывали в 2-3 различных полях и фиксировали с помощью конфокальной микроскопии.

Ki-67 экспрессируется в ядре пролиферирующих клеток в фазах G ₁ , S, G ₂ и M, но отсутствует в непролиферативной фазе G ₀ клеточного цикла (18, 19, 27, 28). Уменьшение количества клеток Ki-67 (+) после обработки экстрактом белка AV указывает на подавление пролиферации клеток.Отсутствие изменений в генах, связанных с апоптозом, подтверждает идею о том, что компоненты экстракта подавляют пролиферацию, а не усиливают апоптоз.

c-MYC, CCND1 и CCND2 — регуляторы клеточного цикла, экспрессия которых положительно коррелирует с пролиферацией клеток (29). Мы оценили экспрессию мРНК c-MYC во всех протестированных линиях нейробластомы, но не наблюдали никаких или едва определяемых уровней (данные не показаны). Таким образом, далее мы оценили только экспрессию мРНК CCND1 и CCND2 .У взрослых мышей мутации CCND2 с потерей функции отменяют пролиферацию нейрональных предшественников (30). Кроме того, среди циклинов D-типа ( CCND1, CCND2 и CCND3 ) только мРНК CCND2 , как сообщается, экспрессируется в делящихся нейрональных предшественниках. Это открытие предполагает, что CCND2 играет главную роль в пролиферации нейрональных клеток.

Анализ экспрессии гена клеток IMR-32, культивированных с экстрактом белка алоэ вера (AV). (A) Клетки IMR-32 культивировали в присутствии экстракта в течение 1 и 2 дней и оценивали относительную экспрессию транскриптов CCND1 (слева) и CCND2 (справа) с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР). Экспрессия CCND2 не определялась (N.D.) в обработанных экстрактом клетках на 1 день. (B) Экспрессия генов, связанных с апоптозом (BAX и BCL-2), и гена MCL-1, связанного с выживанием клеток, оценивали с помощью ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК были нормализованы к мРНК ACTB и показаны как относительная экспрессия.

Белки, экстрагированные из АВ, обладают иммуностимулирующей активностью (31, 32). Например, у мышей ATF1011, немитогенный лектин, очищенный из листьев Aloe arborescens Miller, стимулирует противоопухолевый иммунитет путем активации Т-лимфоцитов (32).Гликопротеин алоктин А, полученный из листьев Aloe arborescens , оказывает профилактическое действие на асцитную опухоль Эрлиха у мышей (31). Однако влияние экстрактов AV-белка на пролиферацию раковых клеток остается неясным. Здесь мы продемонстрировали антипролиферативную активность экстракта белка AV на линии клеток нейробластомы человека. Дальнейшая протеомная идентификация белковых компонентов в сырых белковых экстрактах позволит нам определить механизмы, лежащие в основе антипролиферативной активности AV, усилия, которые могут привести к разработке новых методов лечения нейробластомы.

Благодарности

Мы благодарим г-жу Наоко Кодзима, г-жу Муттику Мадтукунг и г-на Энтони Суэйна за их техническую поддержку. Мы также благодарим доктора Элизу Ламар за критическое прочтение этой рукописи.

• Получено 3 апреля 2015 г.
• Исправление получено 10 мая 2015 г.
• Принято 12 мая 2015 г.

• Copyright © 2015 Международный институт противораковых исследований (доктор Джон Г. Делинассиос), Все права защищены

% PDF-1.4 % 1444 0 объект > endobj xref 1444 76 0000000016 00000 н. 0000004263 00000 н. 0000004460 00000 н. 0000004497 00000 н. 0000005575 00000 п. 0000005694 00000 п. 0000005832 00000 н. 0000005988 00000 н. 0000006144 00000 п. 0000006298 00000 н. 0000006451 00000 п. 0000006605 00000 н. 0000006759 00000 н. 0000006915 00000 н. 0000007071 00000 н. 0000007227 00000 н. 0000007382 00000 н. 0000007930 00000 н. 0000008327 00000 н. 0000008611 00000 п. 0000009415 00000 н. 0000009897 00000 н. 0000010304 00000 п. 0000010773 00000 п. 0000010888 00000 п. 0000011001 00000 п. 0000011272 00000 п. 0000011943 00000 п. 0000012223 00000 п. 0000012736 00000 п. 0000013013 00000 п. 0000013383 00000 п. 0000013668 00000 п. 0000014639 00000 п. 0000014784 00000 п. 0000014813 00000 п. 0000015438 00000 п. 0000016394 00000 п. 0000017406 00000 п. 0000018279 00000 п. 0000019164 00000 п. 0000020108 00000 п. 0000020899 00000 н. 0000021735 00000 п. 0000021801 00000 п. 0000049917 00000 н. 0000049983 00000 н. 0000098546 00000 п. 0000098612 00000 п. 0000132139 00000 н. 0000132205 00000 н. 0000149675 00000 н. 0000149741 00000 н. 0000150271 00000 н. 0000150337 00000 н. 0000150623 00000 н. 0000150689 00000 н. 0000192140 00000 н. 0000192206 00000 н. @

Plantae | Еженедельник «Исследования растений»: 22 января 2021 г.

Обзор: молекулярные механизмы, участвующие в функциональной макроэволюции факторов транскрипции растений

Факторы транскрипции (TF) — очень важные акторы, через которые может действовать эволюция.Было показано, что в каждом организме и системе, начиная с основополагающих работ Джейкоба и Моно, они являются мощными регулирующими белками. Здесь Романи и Морено рассматривают вклад факторов транскрипции растений в эволюцию растений. Геномные исследования показали, что ключевые инновации сопровождались расширением семейств ТФ и неофункционализацией. Здесь авторы рассматривают функциональные исследования, изучающие TFs и генно-регуляторные сети у Marchantia , Physcomitrium и других недавно появившихся моделей не покрытосеменных.Они пришли к выводу, что, несмотря на миллионы лет дивергенции, функции большинства TFs в значительной степени сохраняются у растений, особенно у тех, которые участвуют в процессах развития, но в меньшей степени у тех, кто участвует в реакциях окружающей среды, которые могли быть приобретены в значительной степени независимо. (Резюме Мэри Уильямс @PlantTeaching) New Phytol. 10.1111 / nph.17161

Обзор: генетический контроль развития суккулентных листьев

Суккулентность дает растениям способность накапливать воду и поэтому обычно ассоциируется с растениями из засушливых сред, такими как знакомые алоэ и агава.Здесь Хейдук рассматривает генетический контроль сочности листьев. Суккулентность обычно включает большие, сильно вакуолизированные клетки, но неудивительно, что суккулентность принимает разные формы (например, увеличены ли все клетки, количество клеточных слоев, структура сосудистых тканей). В этом обзоре автор обсуждает вклад в суккулентность молекулярных игроков, известных из модельных растений, которые участвуют в формировании паттерна, делении и размножении клеток. Как она отмечает, возможность введения одного или двух слоев клеток, способных накапливать воду, может быть большим преимуществом для богарных культур, которые периодически испытывают нехватку воды.(Резюме Мэри Уильямс @PlantTeaching). Curr. Мнение. Plant Biol. 10.1016 / j.pbi.2020.11.003

Лигаза NOT4A E3 Arabidopsis способствует экспрессии PGR3 и регулирует трансляцию хлоропластов

пентатрикопептидного повтора (PPR), кодируются ядром с функциями в хлоропласте, но регуляция экспрессии гена PPR в ядре перед импортом в хлоропласт изучена недостаточно. Bailey et al. идентифицировали и охарактеризовали убиквитинлигазу NOT4A и ее регуляторную функцию в отношении PGR3, белка PPR, важного для нескольких фотосинтетических процессов.Мутант not4a имел бледно-желтую окраску, задержку цветения и истощение запасов крахмала по сравнению с диким типом. Секвенирование РНК и протеомика подтвердили, что некоторые комплексные белки фотосистемы II и цитохрома b ₆ f неправильно регулируются у мутанта not4a . Белки субъединицы 30 S рибосомы хлоропласта были истощены по not4a , хотя они были повышены в наборе данных по РНК. Мутант not4a был гиперчувствителен к пластидному ингибитору рибосом линкомицину, а растения дикого типа, обработанные линкомицином, фенокопированы необработанными not4a , что позволяет предположить, что трансляция мРНК хлоропластов нарушена у мутанта not4a . Наконец, экспрессия PGR3 была значительно подавлена ​​в комплементах экспрессии not4a, и PGR3 , нарушенных мутантными функциями хлоропластов not4a . Взятые вместе, исследования показывают, что NOT4A необходим для правильной фотосинтетической функции и положительно регулирует PGR3 и трансляцию хлоропластов. (Резюме Толувасе Олукайоде @toluxylic) Nature Comms. 10.1038 / с41467-020-20506-4

Холодный перевод: Опосредованное рибосомами ингибирование трансляции определяет холодовой стресс у растений

Падение температуры окружающей среды отрицательно сказывается на росте и развитии растений.В то время как первичный молекулярный путь в ответ на холодовой стресс включает экспрессию факторов транскрипции CBF, Гийом-Шёпфер и его коллеги обнаружили, что индуцированное холодовым стрессом ингибирование аппарата трансляции рибосом контролирует экспрессию CBF . Для начала выяснилось, что скорость синтеза белка пропорциональна снижению температуры. Авторы показали, что циклогексимид (CHX) специфически индуцирует быструю экспрессию CBF и других генов, чувствительных к холоду.Поразительно, что для этой CHX-опосредованной индукции холодовых генов требуются функциональные белки CALMODULIN-BINDING TRANSCRIPTION ACTIVATOR (CAMTA), которые являются вышестоящими регуляторами CBF s. Кроме того, авт. Показали, что опосредованное CHX повышение уровней кальция в цитозоле и безъядерном состоянии необходимо для экспрессии CBF , которая, возможно, работает через CAMTA. Вместе они предполагают, что рибосомы являются «криосенсорами», контролирующими раннюю фазу экспрессии генов в ответ на холодовой стресс.(Резюме Павитрана Нараянана @pavi_narayanan). bioRxiv 10.1101 / 2020.12.07.414789v1.full

BONZAI выступают в качестве узловых регуляторов реакции на осмотический стресс

Растения начинают свою реакцию на осмотический стресс с внезапного всплеска уровней цитозольного Ca ²⁺ , что впоследствии приводит к накоплению фитогормона абсцизовой кислоты (ABA). Это далее инициирует цепочку событий, включая закрытие устьиц, крупномасштабные транскрипционные изменения, замедление общего роста и начало раннего старения.Однако механизм, с помощью которого первоначальный всплеск Ca ²⁺ , вызванный осмотическим стрессом, приводит к накоплению АБК, остается малоизученным. В своем недавнем исследовании Chen et al. идентифицировали кальций-связывающий белок BONZAI1 (BON1) как ключевую молекулярную связь между этими событиями. Мутация BON1 отдельно или в комбинации с его функционально перекрывающимися паралогами BON2 и BON3 не только препятствовала передаче сигналов Ca ²⁺ , но также уменьшала накопление ABA, что приводило к серьезным нарушениям реакции на осмотический стресс у проростков арабидопсиса.Авторы показали, что BONs опосредуют изменения транскрипции нескольких генов адаптации в ответ на осмотический стресс, большая часть из которых регулируется независимо от ABA. Кроме того, BON играют решающую роль в поддержании вегетативного роста при осмотическом стрессе, который также происходит в значительной степени независимо от ABA. Следовательно, BON действуют в восходящем направлении как зависимых от ABA, так и независимых от ABA ответов, координируя их активацию при осмотическом стрессе. Интересно, что авторы также обнаружили, что BON способствуют реакции на осмотический стресс путем подавления опосредованной рецептором NLR передачи иммунных сигналов, что указывает на их роль в уравновешивании антагонизма между ответами на абиотический и биотический стресс для оптимизации выживания растений.(Резюме Ядукришнана Премачандрана @yadukrishprem) Curr. Биол. 10.1016 / j.cub.2020.09.016

Этиленовые факторы ответа 15 и 16 запускают биосинтез жасмоната в томатах при устойчивости к травоядным

Ущерб урожаю и потеря урожая, вызванные травоядными животными, стали серьезной угрозой для глобальной продовольственной безопасности. При ранении и травоядности растения быстро накапливают высокие уровни жасмоната (JA). Однако механизм, лежащий в основе того, как биосинтез JA запускается атакой травоядных, остается неясным. Поэтому важно идентифицировать ключевые регуляторные компоненты, участвующие в передаче сигналов JA, индуцированной травоядными животными, и изучить их роль в устойчивости. Hu et al. показали, что защита томатов против хлопковой совки Helicoverpa armigera ( H. armigera ) организована как JA, так и этиленом. Авторы идентифицировали два этилен-индуцированных гена ETHYLENE RESPONSE FACTOR (ERF), а именно, ERF15 и ERF16 , как факторы транскрипции, способные связываться с промоторами генов биосинтеза JA и запускать нижестоящую передачу сигналов JA.Интересно, что растения, лишенные ERF15 и ERF16 , проявляли повышенную чувствительность к H. armigera из-за снижения уровней JA и экспрессии гена биосинтеза JA. Интересно, что JA-активированные MYC2 и ERF16 также могут связываться с промотором ERF16 для активации его экспрессии. В целом Hu et al. идентифицировали новый уровень регуляции защиты томатов против H. armigera , где этилен-чувствительные ERF15 и ERF16 действуют как позитивные регуляторы взрыва JA в томате в ответ на H. armigera. (Резюме Сары Курбье @Scourbier) Plant Physiol. 10.1093 / plphys / kiaa089

Технологии улучшения семян для улучшения прорастания и всхожести австралийских местных Poaceae

Одним из наиболее значительных ограничений в проектах восстановления на основе семян является то, что некоторые местные виды демонстрируют низкое пополнение в поле. В результате разрабатываются различные технологии улучшения семян (SET) для улучшения прорастания и появления всходов за счет облегчения доступа к питательным веществам и воде.Более того, они могут включать химические вещества, улучшающие прорастание (GEC), которые помогают семенам преодолевать период покоя. В этом исследовании Беверидж и его коллеги проверяют влияние различных комбинаций SET и GEC на прорастание трех видов австралийских трав. Семена обрабатывали тремя SET (грунтовка семян, покрытие семян и печенье с семенами) в сочетании с двумя GEC (дымовая вода, KNO3 или оба) и высаживали в горшки с двумя контрастирующими типами почвы. Независимо от почвы, семенное печенье снижает всхожесть, вероятно, потому, что оно механически ограничивает развитие рассады.Напротив, покрытие и грунтовка семян по крайней мере одним GEC значительно улучшило прорастание, предположительно помогая семенам нарушить покой и возобновить метаболическую активность. Таким образом, это исследование показывает потенциал SET для повышения эффективности стратегий восстановления на основе семян. Более того, он обеспечивает полезную основу для будущих усилий по расширению использования этих технологий у других местных видов. (Резюме Карлос А. Ордоньес-Парра @caordonezparra) Seed Sci. Res. 10.1017 / S0960258520000276

фармацевтических препаратов | Бесплатный полнотекстовый | Молекулярные механизмы тератогенного действия талидомида

[Полный текст] Противоопухолевый эффект алоэ-эмодина на клетки рака шейки матки был определен в ассоциации

Введение

Алоэ-эмодин (1,8-дигидрокси-3-гидроксиметил-9,10-антрацендион, AE), природное соединение из корня и корневища Rheum palmatum , оказывает антипролиферативное действие на различные линии раковых клеток человека . Согласно предыдущим сообщениям, AE может ингибировать инвазию клеток карциномы носоглотки, ¹ клеток KB рака полости рта человека и клеток гепатокарциномы. ^2,3 Кроме того, AE также был использован в качестве ингибитора роста клеток рака шейки матки. ⁴

Рак шейки матки является наиболее распространенным гинекологическим злокачественным новообразованием, по частоте встречаемости он является самым высоким среди злокачественных опухолей у женщин и уступает только раку груди во всем мире. ^5,6 В настоящее время терапией рака шейки матки в основном являются хирургическое лечение, лучевая терапия, химиотерапия и другие комбинированные методы лечения. ⁷ Как и другие злокачественные опухоли, факторы, влияющие на выживаемость пациентов, включают плохой прогноз, инвазию опухоли и метастазирование на поздней стадии. ⁶ Поэтому очень важно изучить эффективный метод диагностики и лечения рака шейки матки.

Доказательства показывают, что инфекция вирусом папилломы человека (ВПЧ), связь которой с раком человека была впервые предложена более трех десятилетий назад Харальдом цур-Хаузеном, ⁸ , практически присутствует во всех случаях рака шейки матки. ВПЧ16 и ВПЧ18 относятся к вирусу ВПЧ высокого риска и являются наиболее часто встречающимися типами рака шейки матки во всем мире, составляя примерно 50% и 20% случаев соответственно.Продукты ранних генов ВПЧ слизистых оболочек высокого риска, Е6 и Е7, играют ключевую роль в развитии рака, связанного с ВПЧ. ⁹ Исследования показали, что существует устойчивая экспрессия вирусных белков E6 и E7 в поражениях и раковых опухолях, связанных с ВПЧ, которые считались основным индуктором трансформации клеток. ^10,11

Метаболизм глюкозы обеспечивает энергией процесс роста опухолевых клеток. ¹² Белки-переносчики глюкозы (GLUT), которые опосредуют захват глюкозы, являются основным переносчиком.Облегчающие переносчики глюкозы транспортируют глюкозу через гидрофобную клеточную мембрану по градиенту концентрации без потребления энергии. ¹³ На данный момент идентифицировано восемь видов белков-переносчиков глюкозы (переносчиков глюкозы) (Glut1-5 и Glut7-9). GLUT1 присутствует в различных количествах во многих тканях и, как полагают, отвечает за базальное поглощение глюкозы. ¹⁴ Повышенная экспрессия GLUT1 была обнаружена при многих видах рака, включая рак шейки матки, рак шейки матки, рак легких и колоректальный рак. ^15–18

В этом исследовании, чтобы изучить потенциальный механизм НЯ при раке шейки матки, мы исследовали влияние НЯ на экспрессию Е6 / Е7 ВПЧ и метаболизм глюкозы в HeLa, а также в клетках SiHa, обнаружив, что НЯ может способствовать апоптозу. клеток рака шейки матки путем ингибирования экспрессии Е6 / Е7 ВПЧ и регулирования метаболизма глюкозы.

Материалы и методы

Культура клеток и лекарственная обработка

Клеточные линии рака шейки матки человека Hela и SiHa были приобретены из банка клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай).Все клетки культивировали в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM, Gibco, Карлсбад, Калифорния, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и 1% пенициллин-стрептомицина при 37 ℃ с 5% СО ₂ . 0,1 М исходный раствор AE (Sigma), растворенный в диметилсульфоксиде (ДМСО), разбавляли до рабочих концентраций средой DMEM для стимуляции клеток. В отрицательный контроль добавляли такой же объем ДМСО в культуральную среду.

Трансфекция клеток

Сверхэкспрессию GLUT1 проводили в соответствии с протоколом, описанным ранее. ¹⁹ Вкратце, когда клетки Hela в 6-луночных планшетах росли до 60-70% конфлюэнтности, 4 мкг пустых векторов pcDNA3.1 или 4 мкг pcDNA3.1-GLUT1 трансфицировали в клетки с реагентом Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в сыворотке крови. свободную среду, которую через 5 часов заменяли полной средой, содержащей 10% FBS. Через 2 дня клетки обрабатывали АЕ, как указано выше.

Анализ МТТ

МТТ [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-2H-тетразолий бромид] использовали для измерения роста жизнеспособных клеток.1 × 10 ⁵ клеток / лунку высевали в 96-луночные планшеты с последующей обработкой AE в различных дозах (10, 20, 50, 100, 200 мкМ) в течение 24 часов. Затем клетки инкубировали с раствором МТТ в течение 4 часов, который растворяли формазаном. Наконец, значения оптической плотности (OD) определяли при 550 нм с помощью ридера Wellscan (Labsystems, Санта-Фе, Нью-Мексико, США). Скорость пролиферации клеток рассчитывали следующим образом: (OD _{, эксперимент} / OD _{, контроль} ) × 100%. ²⁰

Анализ апоптоза клеток с помощью проточной цитометрии

4 × 10 ⁵ Клетки Hela и SiHa на лунку поддерживали в среде в течение ночи для прилипания, а затем вводили AE (50 мкМ, 100 мкМ) в течение 24 часов.Морфологические характеристики клеток наблюдали с помощью инвертированного микроскопа. Анализ проточной цитометрии проводили с помощью набора для обнаружения апоптоза Annexin V-FITC / PI (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя.

Вестерн-блоттинг

2 × 10 ⁵ клеток лизировали буфером для иммунопреципитации на льду и центрифугировали при 13000 × g в течение 15 мин при 4 ° С для сбора супернатанта. Лизаты кипятили и 40 мкг общих клеточных лизатов разделяли электрофорезом в 10% -ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), который переносили на поливинилиденфторидную мембрану (Millipore, Bedford, MA, USA).Полосы белка детектировали путем инкубации с антителами, включая анти-HPV16 / 18 E6, E7, GLUT1 и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH), от Boster Bioengineering (Ухань, Китай). Для визуализации белков использовали реагенты с усиленной хемилюминесценцией (Beyotime), а для измерения относительной экспрессии белков применяли программное обеспечение image J.

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR)

Два микрограмма общей РНК, которые были экстрагированы из трансфицированных клеток с использованием реагента TRIzol (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США), были преобразованы в кДНК с помощью набора High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).ПЦР в реальном времени выполняли с использованием Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Калифорния, США) для анализа уровней экспрессии генов и скорости репликации клеток рака шейки матки. Ген GAPDH использовали в качестве эндогенного контроля. Значения относительной экспрессии были измерены с помощью метода 2-ΔΔCt. Последовательности праймеров были описаны в таблице 1.

Анализ метаболизма глюкозы, включая поглощение глюкозы, продукцию

клеток HeLa и SiHa голодали в течение ночи в бессывороточной среде, а затем обрабатывали АЕ в концентрациях 50 и 100 мкМ в течение 0, 4, 8, 12 и 24 часов.Согласно инструкциям производителей, анализ поглощения глюкозы проводили с помощью набора для анализа поглощения глюкозы (ab136955, Abcam). Продукция лактата анализировалась с использованием набора для анализа l-лактата (ab65331, Abcam). Измерение АТФ проводили с помощью набора для анализа АТФ (ab83355, Abcam). Относительное поглощение глюкозы, продукция лактата и продукция АТФ в группах AE рассчитывались с процентным содержанием группы DMSO.

Статистический анализ

Все данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение.Статистический анализ проводился с помощью программы SPSS 12.0. Статистически значимым считалось значение p <0,05.

Результаты

Влияние AE на рост клеток рака шейки матки

МТТ-анализ проводили для оценки влияния АЕ на рост клеток. Клетки Hela и SiHa обрабатывали АЕ в концентрациях от 10 до 200 мкМ. Как показано на Фигуре 1A, AE, очевидно, ингибировал рост клеток в зависимости от концентрации.Чтобы оценить влияние AE на апоптоз клеток, клетки Hela и SiHa обрабатывали AE в концентрациях 50 и 100 мкМ в течение 24 часов, демонстрируя, что AE заметно увеличивал скорость апоптоза в клетках Hela и SiHa (рис. 1B).

Влияние АЕ на экспрессию Е6 и Е7 ВПЧ-16/18

qRT-PCR и WB анализ использовали для определения уровней мРНК и белка E6 и E7 HPV-16/18 в клетках Hela и SiHa после обработки AE.Было показано, что уровни мРНК HPV18-E6 / E7 и HPV16-E6 / E7 ингибируются зависимым от концентрации образом в клетках Hela (Рисунок 2A) и в клетках SiHa (Рисунок 2B), соответственно. Соответственно, аналогичные результаты были выявлены на уровне белка. Как показано на рис. 2C – D, уровни белков E6 и E7 были значительно подавлены в клетках Hela и SiHa с соответствующим количественным анализом на гистограмме.

Влияние АЕ на метаболизм глюкозы в клетках рака шейки матки

Известно, что злокачественные клетки ускоряют метаболизм, повышают потребность в глюкозе и повышают ее усвоение.Чтобы оценить влияние АЕ на метаболизм клеток, измеряли поглощение глюкозы, продукцию лактата и продукцию АТФ. Клетки Hela и siHa обрабатывали АЕ в концентрациях 50 и 100 мкМ, что показывает, что АЕ ингибирует метаболизм, контролируя поглощение глюкозы (Рисунок 3A), производство лактата (Рисунок 3B) и производство АТФ (Рисунок 3C) в зависимости от концентрации и времени. манера.

AE ингибирует метаболизм глюкозы за счет снижения экспрессии GLUT1 в клетках рака шейки матки

Транспортировка глюкозы через цитоплазматическую мембрану млекопитающих, которая опосредуется GLUT, является первой лимитирующей стадией метаболизма глюкозы.Таким образом, мы предположили, что ингибирующий эффект AE на метаболизм опухоли был достигнут путем корректировки уровня GLUT. Как и ожидалось, AE, очевидно, снижает уровень мРНК GLUT1 в клетках HeLa и SiHa (рис. 4A – B). Кроме того, экспрессия белка GLUT1 также была значительно подавлена ​​AE (рис. 4C – D). Однако, когда GLUT1 был сверхэкспрессирован в клетках HeLa, ингибирующие эффекты AE на поглощение глюкозы, производство молока и АТФ были заметно ослаблены (Рисунок 5B – D). Эти результаты показали, что AE ингибирует метаболизм глюкозы за счет снижения экспрессии GLUT1.Эффективность трансфекции pcDNA3.1-GLUT1 оценивалась WB. Как показано на рисунке 5A, клетки HeLa, трансфицированные pcDNA3.1-GLUT1, показали гораздо более высокий уровень GLUT1, чем клетки, трансфицированные векторами pcDNA3.1.

Избыточная экспрессия GLUT1 ингибировала апоптоз клеток рака шейки матки, индуцированный АЕ

МТТ (фиг. 6А) показал, что при стрессе АЕ сверхэкспрессия GLUT1 значительно способствовала пролиферации клеток HeLa по сравнению с клетками, трансфицированными pcDNA3.1 векторов. Анализ проточной цитометрии (фиг. 6B и C) показал, что избыточная экспрессия GLUT1, очевидно, снижает апоптоз, индуцированный AE.

Обсуждение

Было обнаружено, что AE, как традиционное восточное растение, обладает противораковыми функциями в нескольких линиях раковых клеток. ^21,22 Что еще более важно, явной токсичности AE in vivo не наблюдалось. ²¹ Однако противоопухолевые молекулярные механизмы AE все еще неясны, особенно для клеток рака шейки матки.

Вирус папилломы человека высокого риска (hrHPV) был определен как ключевой фактор в развитии рака шейки матки. ²³ Рак, связанный с ВПЧ, тесно связан с сохранением ВПЧ и накоплением хромосомной рекомбинации. ⁹ Среди ранних генов E6 и E7 являются двумя наиболее известными онкогенными белками, которые постоянно экспрессируются при злокачественных новообразованиях, связанных с ВПЧ, и ответственны за пролиферацию раковых клеток. Доказательства показали, что экспрессия E6 и E7 во время естественной инфекции HPV может эффективно иммортализовать клетки.Однако ингибирование экспрессии E6 и E7 может блокировать злокачественный фенотип клеток рака шейки матки. ⁷ В настоящем исследовании мы обнаружили, что AE ингибирует пролиферацию и способствует апоптозу клеток Hela и SiHa, что согласуется с результатами других исследований. Чтобы изучить механизм, ответственный за ингибирование AE на рост клеток, WB и PCR были использованы для определения уровней E6 / E7, показывающих, что AE значительно снижает экспрессию мРНК и белка. Эти результаты предполагают, что апоптоз клеток рака шейки матки, индуцированный AE, был связан с экспрессией E6 / E7.

Конститутивное поглощение глюкозы является отличительной чертой раковых клеток и обеспечивает энергию и биосинтетический материал для пролиферации раковых клеток. ²⁴ Злокачественные клетки ускоряют метаболизм и нуждаются в большем производстве АТФ. Впервые Варбург ²⁵ заметил, что скорость аэробного гликолиза увеличивалась в раковых клетках, что приводило к накоплению лактата из-за повышенных уровней лактатдегидрогеназы, превращающей пируват в лактат. ²⁶ Более того, другие исследования предполагают, что опухоли используют лактат в качестве топлива, расширяя его метаболические функции при раке. ²⁷ Мы предположили, что AE подавляет клетки рака шейки матки, регулируя метаболизм глюкозы. Таким образом, поглощение глюкозы, производство лактата и производство АТФ были измерены в клетках Hela и SiHa после обработки AE в дозах 50 и 100 мкМ, и результат показал, что AE действительно ингибировал метаболизм глюкозы в зависимости от концентрации и времени.

Мы предположили, что ингибирующий эффект AE на метаболизм опухоли был достигнут путем регулирования уровня GLUT 1. Чтобы определить, связан ли ограниченный метаболизм с GLUT1, экспрессию GLUT1 и относительную мРНК измеряли в клетках Hela и SiHa, обработанных AE. .Результаты показали, что уровень белка и уровень мРНК GLUT1 имеют отрицательную корреляцию с AE в зависимости от концентрации. Другими словами, AE подавляет экспрессию GLUT1.

Для дальнейшей проверки роли GLUT1 в противоопухолевом эффекте AE мы сверхэкспрессировали GLUT1 в клетках Hela. Как и ожидалось, сверхэкспрессия GLUT1 не только ослабляла ингибирующие эффекты АЕ на поглощение глюкозы, продукцию молочной железы и продукцию АТФ, но также уменьшала апоптоз клеток, индуцированный АЕ.Взятые вместе, эти данные продемонстрировали, что AE оказывает противоопухолевый эффект за счет ингибирования метаболизма глюкозы.

Заключение

В этом исследовании мы обнаружили, что противоопухолевый эффект AE на клетки рака шейки матки был связан с HPV E6 / E7 и метаболизмом глюкозы. Сообщалось об исследованиях, что сверхэкспрессия E6 / E7 увеличивала уровень белка и мРНК GLUT1 в клетках рака легких. ²⁸ Итак, мы продолжим исследовать взаимосвязь между E6 / E7 и GLUT1 в противоопухолевом эффекте AE при раке шейки матки.Более того, противоопухолевый эффект AE in vivo также требовал дальнейшего изучения.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами научно-исследовательского проекта муниципальной комиссии по планированию здравоохранения (№: [2016] 002) и научно-исследовательского проекта муниципального бюро науки и технологий (№: [2018] 1-37).

Раскрытие информации

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.

Список литературы

1.Lin ML, Lu YC, Chung JG и др. Подавление MMP-2 через p38 MAPK-NF-kappaB-зависимый путь алоэ-эмодином приводит к ингибированию инвазии клеток карциномы носоглотки. Мол Карциног . 2010. 49 (9): 783–797. DOI: 10.1002 / mc.20652

2. Xiao BX, Guo J. [Двойное действие алоэ-эмодина против пролиферации и миграции на клетки KB и его механизм]. Чжунхуа Коу Цян И Сюэ За Чжи . 2009. 44 (1): 50–52.

3. Чон В., Чон Ю.К., Нам MJ. Апоптоз под действием алоэ-эмодина опосредуется подавляющей регуляцией кальпаин-2 и убиквитин-протеинлигазы E3A в клетках гепатомы человека Huh-7. Сотовый Биол Инт . 2012. 36 (2): 163–167. DOI: 10.1042 / CBI20100723

4. Го Дж.М., Сяо Б.Х., Лю Цюй, Чжан С., Лю Д.Х., Гун Чж. Противоопухолевый эффект алоэ-эмодина на клетки рака шейки матки включает остановку G2 / M и индукцию дифференцировки. Acta Pharmacol Sin . 2007; 28 (12): 1991–1995. DOI: 10.1111 / j.1745-7254.2007.00707.x

5. Паркин Д.М., Брей Ф., Ферли Дж., Пизани П. Глобальная статистика рака, 2002. CA Cancer J Clin . 2005. 55 (2): 74–108.

6.Йошикава Х. [Прогресс в мире и проблемы Японии в области вакцинации против ВПЧ для профилактики рака шейки матки]. Ган То Кагаку Риохо . 2010. 37 (6): 971–975.

7. Элленсон Л.Х., Ву ТК. Сосредоточьтесь на раке эндометрия и шейки матки. Раковая клетка . 2004. 5 (6): 533–538. DOI: 10.1016 / j.ccr.2004.05.029

8. Цур Хаузен Х. Папилломавирусы и рак: от фундаментальных исследований до клинического применения. Нат Рев Рак . 2002. 2 (5): 342–350. DOI: 10.1038 / nrc798

9.Гиттони Р., Аккарди Р., Хасан У., Гейт Т., Силла Б., Томмазино М. Биологические свойства онкопротеинов Е6 и Е7 из вирусов папилломы человека. Гены вирусов . 2010; 40 (1): 1–13. DOI: 10.1007 / s11262-009-0412-8

10. Месри Э.А., Фейтельсон М.А., Мангер К. Вирусный онкогенез человека: анализ признаков рака. Клеточный микроб-хозяин . 2014. 15 (3): 266–282. DOI: 10.1016 / j.chom.2014.02.011

11. Маклафлин-Друбин М.Э., Мунгер К. Онкогенная активность вирусов папилломы человека. Вирус Res . 2009. 143 (2): 195–208. DOI: 10.1016 / j.virusres.2009.06.008

12. Brahimi-Horn C., Pouyssegur J. Роль индуцируемого гипоксией фактора в росте и инвазии метаболизма опухоли. Бычий рак . 2006; 93 (8): E73 – E80.

13. Македа М.Л., Роджерс С., Лучший доктор медицины. Молекулярная и клеточная регуляция белков-переносчиков глюкозы (GLUT) при раке. J Cell Physiol . 2005. 202 (3): 654–662. DOI: 10.1002 / jcp.20166

14. Бирнбаум MJ, Haspel HC, Rosen OM.Клонирование и характеристика кДНК, кодирующей белок-переносчик глюкозы в головном мозге крысы. Proc Natl Acad Sci U S A . 1986. 83 (16): 5784–5788.

15. Рудловски С., Беккер А.Дж., Шредер В., Рат В., Баттнер Р., Мозер М. Информационная РНК GLUT1 и индукция белка связаны со злокачественной трансформацией рака шейки матки. Ам Дж. Клин Патол . 2003. 120 (5): 691–698. DOI: 10.1309 / 4KYN-QM58-62JW-2GD7

16. Кантуария Г., Фаготти А., Феррандина Г. и др. Экспрессия GLUT-1 при карциноме яичников: связь с выживаемостью и ответом на химиотерапию. Рак . 2001. 92 (5): 1144–1150.

17. Хигаши К., Уэда Й., Сакураи А. и др. Корреляция экспрессии переносчика глюкозы Glut-1 с поглощением [(18) F] FDG при немелкоклеточном раке легкого. Eur J Nucl Med . 2000. 27 (12): 1778–1785. DOI: 10.1007 / s0025

367

18. Haber RS, Rathan A, Weiser KR, et al. Экспрессия переносчика глюкозы GLUT1 при колоректальной карциноме: маркер плохого прогноза. Рак . 1998. 83 (1): 34–40.

19. Ляо Х, Ван З., Дэн З., Рен Х, Ли Х.Куркумин подавляет инвазию и метастазирование рака легких, ослабляя путь GLUT1 / MT1-MMP / MMP2. Int J Clin Exp Med . 2015; 8 (6): 8948–8957.

20. Го Дж. М., Сяо Б. Х, Дай Диджей, Лю Цюй, Ма ХХ. Влияние даидзеина на эстроген-рецептор-положительные и отрицательные клетки рака поджелудочной железы in vitro. Мир J Гастроэнтерол . 2004. 10 (6): 860–863.

21. Pecere T, Gazzola MV, Mucignat C, et al. Алоэ-эмодин — это новый тип противоопухолевого средства с избирательной активностью против нейроэктодермальных опухолей. Cancer Res . 2000. 60 (11): 2800–2804.

22. Миятович С., Максимович-Иванич Д., Радович Дж. И др. Антиглиомное действие алоэ эмодина: роль ингибирования ERK. Cell Mol Life Sci . 2005. 62 (5): 589–598. DOI: 10.1007 / s00018-005-4425-8

23. Хуан СС, Хао Д.З., Чжан Ю., Лю Х.М., Шань В.С. Прогресс в исследованиях механизмов и клинической диагностики рака шейки матки, связанных с геномной интеграцией ДНК вируса папилломы человека высокого риска. И Чуань .2017; 39 (9): 775–783. DOI: 10.16288 / j.yczz.17-151

24. Ханахан Д., Вайнберг Р.А. Признаки рака: следующее поколение. Ячейка . 2011. 144 (5): 646–674. DOI: 10.1016 / j.cell.2011.02.013

25. Варбург О. О происхождении раковых клеток. Наука . 1956; 123 (3191): 309–314.

26. Shim H, Dolde C, Lewis BC, et al. c-Myc трансактивация ЛДГ-А: влияние на метаболизм и рост опухоли. Proc Natl Acad Sci U S A . 1997. 94 (13): 6658–6663.

27. Faubert B, Li KY, Cai L, et al. Метаболизм лактата при опухолях легких человека. Ячейка . 2017; 171 (2): 358–371.e359. DOI: 10.1016 / j.cell.2017.09.019

28. Fan R, Hou WJ, Zhao YJ, et al. Сверхэкспрессия Е6 / Е7 HPV16, опосредованная HIF-1α, повышающая регуляцию экспрессии GLUT1 в клетках рака легких. Биол опухолей . 2016; 37 (4): 4655–4663. DOI: 10.1007 / s13277-015-4221-5